一种双佐剂-新抗原肿瘤纳米疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种纳米疫苗，它是同时装载有肿瘤新生抗原及其两种佐剂的纳米颗粒。本发明专利技术还提供用于制备所述纳米疫苗的一种组合物，包括小分子佐剂R848、末端修饰马来酰胺键的含聚乙二醇链段的两亲性二嵌段聚合物、核酸佐剂CpG、聚乙二醇修饰的聚多肽和肿瘤新生抗原。本发明专利技术的纳米疫苗在体内外均有显著的免疫激活效果以及良好的抗原特异性肿瘤抑制效果。本发明专利技术还提供制备所述纳米疫苗的方法及所述纳米疫苗在制备肿瘤疫苗药物中的应用。

A new tumor nano vaccine with double adjuvant and new antigen and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种双佐剂-新抗原肿瘤纳米疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于纳米药物
，尤其涉及肿瘤纳米疫苗类药物的制备方法和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是全球发病和死亡的重要原因之一。全球接近六分之一的死亡是由于癌症，其中约70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。免疫系统在维护人体健康中发挥至关重要的作用。免疫系统在针对重大疾病例如HIV、动脉粥样硬化、自身免疫病以及肿瘤的预防及治疗功能已经被广泛研究。其中，肿瘤免疫治疗领域的兴起给肿瘤治疗带来了新的希望。通过干扰肿瘤免疫循环的各个步骤而开发出的细胞或分子水平的各类免疫治疗药物已经纷纷进入临床实验，其中免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞治疗已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床肿瘤治疗。目前，疫苗是肿瘤免疫治疗的主要方法之一。其主要作用机理是从病原体中分离出来的抗原分子(疫苗)在体内应用可以激活机体的免疫反应及抗原特异性免疫记忆效应，从而有效发挥针对特定病原体的防治作用。过去一个世纪的医疗史已经证实，疫苗凭借其快速、高效的药物作用性质成功挽救了数百万人群的生命而成为最具影响力的独立治疗手段之一。然而，肿瘤疫苗的发展依然面临着两大难题。首先，利用肿瘤细胞过表达的蛋白作为抗原的传统疫苗在实际应用过程中因为中枢耐受而使治疗效果大大受损；其次，疫苗类药物在淋巴器官递送效率低下在一定程度上限制了肿瘤疫苗的进一步开发。随着肿瘤免疫学、肿瘤基因组学以及生物信息学等学科的发展，一类新的肿瘤抗原逐渐进入大家的视野。肿瘤新生抗原(neoantigen)是由肿瘤细胞发生体细胞突变(somaticmutation)或者框架移位突变(frameshiftmutation)形成，这类新抗原只特异存在于肿瘤细胞中，因此中枢免疫耐受的发生几率大大降低。到目前为止，已有不少小型临床实验证实这类新生抗原的免疫治疗作用。然而现有的关于肿瘤新生抗原研究结果显示，大量筛选得到的突变抗原并不具备或具备较弱的免疫原性，因此，如何提升新生抗原的免疫原性使其在体内持久高效发挥抗肿瘤免疫反应是亟待考虑和解决的问题。现有的疫苗类药物研究显示，佐剂及抗原的联合递送可以提升疫苗效果，具体作用机制包括：1)佐剂及抗原可同时激活先天免疫反应和抗原特异性获得性免疫反应(例如T细胞免疫反应)；2)不同佐剂可协同调控多种免疫信号通路；3)多表位抗原的应用可以激活更广范围的免疫反应。临床及实验室研究中较为普遍的联合递送方式即混合递送新抗原多肽和免疫佐剂，这种混合递送方式存在的弊端是：1)游离形式的药物分子到淋巴器官的递送效率低；2)抗原及佐剂在体内的无序分布一定程度上限制了疫苗抗肿瘤作用的发挥。纳米药物已被广泛研究用于癌症免疫治疗。纳米颗粒的使用不仅可以改善疏水药物(小分子，多肽等)的水分散性，而且还可以增强它们的药代动力学和生物体内分布，增强治疗效果并减少副作用。纳米颗粒在疫苗递送中体现出较为明显的优势，包括：1)纳米颗粒独特的尺寸优势(5-100nm)使装载其中的疫苗药物更易递送并长时间停留在淋巴组织(如淋巴结)及抗原递呈细胞(如树突状细胞)中；2)通过对纳米材料结构组成的设计，可以同时装载多种疫苗类药物，从而优化肿瘤疫苗的免疫治疗方案；3)联合装载不同的疫苗类药物可以改善各类药物的药代动力学特性，从而协调发挥各类药物的药学作用。Toll样受体7/8的激动剂(TLR7/8a)imiquimod和resiquimod(R848)已经被美国FDA批准用于临床皮肤病局部治疗，Toll样受体9激动剂(TLR9a)CpG寡核苷酸作为另一类明星佐剂也被广泛应用于各类临床或临床前研究。TLR7/8a和TLR9a通过调控MyD88及其相关的级联信号通路可发挥协同免疫调节作用。然而水溶性及药物代谢动力的差异限制了不同种类疫苗药物的联合使用。常用的生物工程手段一般是将各类疫苗药物连接到亲水性小分子或高分子聚合物上以改善药物的水溶性。与聚合物药物偶连物相比，纳米载体由于其设计和功能的多样性，可以同时实现不同药物在同一载体的联合递送，改善药物的体内分布及代谢。因此，有必要研发一种基于纳米载体的肿瘤纳米疫苗，以实现不同作用机制及理化性质的疫苗类抗原及佐剂在体内由同一载体联合递送。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种纳米疫苗，可作为核酸/小分子佐剂及多肽抗原的载体，在体内外均具有优异的免疫激活效果，并表现出显著的抗原特异性抗肿瘤治疗效果。本专利技术的另一目的是提供制备所述的纳米疫苗的方法。本专利技术的再一目的是提供所述的纳米疫苗在制备抗原特异性肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：首先，本专利技术提供一种纳米疫苗，它是同时装载有肿瘤新生抗原及其两种佐剂的纳米颗粒。本专利技术优选的方案中，所述的肿瘤新生抗原可以选自含有Adpgk肽段的多肽抗原、SIINFEKL抗原或标记FITC荧光分子的模型抗原(CSIINFEK(FITC)L)中的任意一种。本专利技术优选的方案中，所述的两种佐剂包括TLR7/8a激动剂和TLR9a激动剂。本专利技术进一步优选的方案中，所述的TLR7/8a激动剂是R848小分子佐剂；所述的TLR9a激动剂是CpG寡核苷酸。本专利技术优选的方案中，所述的纳米疫苗中还含有聚乙二醇修饰的两亲性聚合物。本专利技术进一步优选的方案中，所述的两亲性聚合物由聚乙二醇-聚乳酸(PEG-b-PLA)和式(I)所示的聚乙二醇修饰的聚多肽(PPT-g-PEG)组成。其中，n和m的和为1，p和q的取值范围均在40～50；优选n和m的和为1且n大于m，p和q均为45-50；最优选n取0.87，m取值范围是0.13，p和q均为45。本专利技术优选的方案中，所述的纳米疫苗是通过以下过程得到的组合物纳米颗粒：PEG-b-PLA和CpG寡核苷酸先聚合组装得到内部为疏水结构的微粒，再利用所述疏水结构将小分子佐剂R848装载于所述微粒内部，然后通过所述微粒中的CpG寡核苷酸和PPT-g-PEG压缩组装，得到表面分布PPT-g-PEG的纳米颗粒，再利用所述纳米颗粒表面PPT-g-PEG的亲疏水作用装载所述的肿瘤新生抗原。在此基础上，本专利技术还提供一种用于制备所述纳米疫苗的组合物，包括：小分子佐剂R848；末端修饰马来酰胺键的含聚乙二醇链段的两亲性二嵌段聚合物；核酸佐剂CpG，包括5’端为巯基修饰的DNA引物片段以及含有两段以上CpG或GpC反义序列的长链DNA模板片段；聚乙二醇修饰的聚多肽；和肿瘤新生抗原，优选多肽抗原Adpgk、SIINFEKL抗原或标记FITC荧光分子的模型抗原(CSIINFEK(FITC)L)中的任意一种。本专利技术组合物中，所述的多肽抗原Adpgk是从鼠源性肿瘤细胞MC38筛选得到的Adpgk(ASMTNRELM→ASMTNMELM)。本专利技术组合物中，所述的末端修饰的马来酰胺键的含聚乙二醇链段的两亲性二嵌段聚合物优选MAL-PEG-PLA；更优选MAL-PEG3000-PLA2000。...

【技术保护点】
1.一种纳米疫苗，其特征在于：它是同时装载有肿瘤新生抗原及其两种佐剂的纳米颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种纳米疫苗，其特征在于：它是同时装载有肿瘤新生抗原及其两种佐剂的纳米颗粒。


2.权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述的肿瘤新生抗原选自含有Adpgk肽段的多肽抗原、SIINFEKL抗原或标记FITC荧光分子的模型抗原(CSIINFEK(FITC)L)中的任意一种，优选含有Adpgk肽段的多肽抗原；所述的两种佐剂包括TLR7/8a激动剂和TLR9a激动剂，所述的TLR7/8a激动剂优选R848小分子佐剂，所述的TLR9a激动剂优选CpG寡核苷酸。


3.权利要求1-2任意一项所述的所述的纳米疫苗，其特征在于：所述的纳米疫苗中还含有两亲性聚合物；所述的两亲性聚合物优选聚乙二醇-聚乳酸(PEG-b-PLA)和式(I)所示的聚乙二醇修饰的多肽(PPT-g-PEG)



其中，n和m的和为1，p和q的取值范围均在40～50；优选n和m的和为1且n大于m，p和q均为45-50；最优选n取0.87，m取值范围是0.13，p和q均为45。


4.权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述的纳米疫苗是通过以下过程得到的组合物纳米颗粒：PEG-b-PLA和CpG寡核苷酸先聚合组装得到内部为疏水结构的微粒，再利用所述疏水结构装载小分子佐剂R848至所述微粒内部，然后通过所述微粒中的CpG寡核苷酸和PPT-g-PEG压缩组装，得到表面分布PPT-g-PEG的纳米颗粒，最后利用所述纳米颗粒表面PPT-g-PEG的亲疏水作用装载所述的肿瘤新生抗原。


5.一种用于制备所述纳米疫苗的组合物，包括：
小分子佐剂R848；
末端修饰马来酰胺键的含聚乙二醇链段的两亲性二嵌段聚合物；
核酸佐剂CpG，包括5’端为巯基修饰的DNA引物片段以及含有两段以上CpG或GpC反义序列的长链DNA模板片段；
聚乙二醇修饰的聚多肽；
和
肿瘤新生抗原；优选多肽抗原Adpgk、SIINFEKL抗原或CSIINFEK(FITC)L中的任意一种。


6.权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述的末端修饰的马来酰胺键的含聚乙二醇链段的两亲性二嵌段聚合物优选MAL-PEG-PLA；更优选MAL-PEG3000-PLA2000。


7.权利要求5所述的组合物，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小元，倪倩倩，
申请(专利权)人：莎穆上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31