一种CD3抗原及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种CD3抗原及其制备方法和用途，其中所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述Fc片段由Fc1片段和Fc2片段通过二硫键形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端与Fc1的N端连接，构成融合蛋白CD3E?ECD-Fc1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3D?ECD-Fc2，或者CD3G?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3G?ECD-Fc2；其中，Fc1片段和Fc2片段的氨基酸序列均为将SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列进行2个或3个氨基酸的点突变获得。本发明专利技术还公开了所述CD3抗原的制备方法及用途。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种CD3抗原及其制备方法和用途，其中所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述Fc片段由Fc1片段和Fc2片段通过二硫键形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端与Fc1的N端连接，构成融合蛋白CD3E?ECD-Fc1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3D?ECD-Fc2，或者CD3G?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3G?ECD-Fc2；其中，Fc1片段和Fc2片段的氨基酸序列均为将SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列进行2个或3个氨基酸的点突变获得。本专利技术还公开了所述CD3抗原的制备方法及用途。【专利说明】一种CD3抗原及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种⑶3抗原及其制备方法和用途。
技术介绍
⑶3是人免疫T细胞表面标记抗原,是由四种亚基(subunit)组成的六聚体,通过电荷吸附作用围绕在T细胞受体(T cell rec印tor，TCR)周围。⑶3的四种亚基分别为CD3 ε (CD3E)，CD3S (CD3D)，CD3y (CD3G)，CD3 ζ (CD3Z)，均为跨膜蛋白；并且 CD3E 与CD3D形成二聚体、CD3E与CD3G形成二聚体(heterodimer)，它们的胞外区通常可以作为抗CD3抗体的识别靶位点。CD3E ECD 为 CD3E 的胞外结构域(extra-cellular domain), CD3D ECD 为 CD3D 的胞外结构域，⑶3G E⑶为⑶3G的胞外结构域。0KT3作为第一个商业化的抗⑶3抗体，其靶点为⑶3E和⑶3G 二聚体的胞外区。0KT3不仅能够结合⑶3，还具有激活T细胞的作用。有研究发现，只有当⑶3E和⑶3G形成了二聚体才具有免疫原性，能被0KT3结合，而单独的CD3E或CD3G均无法被0KT3结合。UCHTl是一个常用的抗⑶3抗体，既能够识别⑶3E和⑶3D 二聚体的E⑶部分，也能识别⑶3E和⑶3G 二聚体的E⑶部分，而单独的⑶3E E⑶、⑶3D E⑶和⑶3G E⑶均无法被UCHTl所识别。目前CD3抗原的制备方法有将CD3E ECD与CD3G ECD融合(CD3E-G ECD fusion);将 CD3E ECD 与 CD3D ECD 融合(CD3E-D ECD fusion);将 CD3E、CD3G 和 CE3D 三种亚基的 ECD与免疫球蛋白IgGl的Fe片段融合(⑶3E/G/D-FC);或者在融合蛋白的C端添加Flag标签(CD3E/G/D-Fc-Flag)或 His 标签(CD3E/G/D-Fc-His)等。其中，CD3E-G ECD 融合蛋白和⑶3E-D E⑶融合蛋白都采用原核表达，存在于包涵体中，纯化后需要进行复性，也有⑶3E/G/D E⑶分别用原核表达，纯化后将⑶3E和⑶3G或⑶3D等比例混合进行复性；原核表达CD3抗原虽然产量高，但是增加了复性步骤，最后得到的具有免疫原性的CD3只有原来的10%甚至更低。⑶3E/G/D-FC重组融合蛋白在293细胞中表达，具有免疫原性，能够被0KT3和UCHTl识别，但是在该抗原的制备过程中也存在有⑶3E-Fc、⑶3D-Fc和⑶3G_Fc所形成的同源二聚体(homodimer)以及Q)3D-Fc-0)3G-Fc异二聚体等杂质蛋白，因此形成异二聚体的效率一般在50%以下。虽然该抗原的制备方法通过采用在不同的Fe片段C端携带不同的标签的技术可以得到纯度大于90%的抗原，但是纯化过程中，需要进行至少三步亲和层析，损失也比较多，导致抗原的收率低于50%。由于目前CD3抗原及其制备方法中存在的上述缺点，有必要开发一种新的异二聚体形成效率高的通过真核表达系统制备的异二聚体的CD3抗原。
技术实现思路
为此，本专利技术提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种⑶3抗原，其中，所述⑶3抗原包括:Fe片段、⑶3的ε亚基⑶3Ε的胞外结构域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亚基⑶3D的胞外结构域⑶3D E⑶或⑶3的Y亚基⑶3G的胞外结构域⑶3GECD ;其中，所述Fe片段由Fcl片段和Fc2片段通过二硫键形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3EE⑶的C端与Fcl的N端连接，构成融合蛋白⑶3E E⑶-Fcl，在第二个融合蛋白中，⑶3D E⑶的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白⑶3D E⑶-Fc2，或者⑶3G E⑶的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白⑶3G E⑶-Fc2 ；其中，Fcl片段和Fc2片段的氨基酸序列均为将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行2个或3个氨基酸的点突变获得。本专利技术还提供了一种⑶3抗原的制备方法，所述方法包括:(I)分别获得重组载体e和重组载体d，或者分别获得重组载体e和重组载体g ；(2)对所述重组载体e和d，或者重组载体e和g进行点突变，获得突变重组载体em和dm,或者获得突变重组载体em和gm ；(3)在真核细胞中转染em和dm ;或者转染em和gm ；(4)利用亲和层析方法纯化获得CD3抗原CD3E/CD3D-Fcl/Fc2或者CD3E/CD3G-Fcl/Fc2 ；其中，所述重组载体e含有融合蛋白⑶3E E⑶-Fcw的编码核苷酸序列；所述重组载体d含有融合蛋白⑶3D E⑶- Fcw的编码核苷酸序列；所述重组载体g含有融合蛋白⑶3GE⑶-Fcw的编码核苷酸序列；其中，Fcw为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所编码的多肽片段。此外，本专利技术还提供了本专利技术所述的CD3抗原在抗CD3抗体的筛选中的用途。通过上述技术方案，本专利技术的⑶3抗原具有如下优点:(I)形成异二聚体的效率高；(2)能够与抗⑶3的抗体发生特异结合,具有很强的亲和力；(3)通过proteinA—步亲和层析，即可得到纯度为95%的蛋白，蛋白的收率不低于80% (从表达上清中提纯出来的最终产量与原上清中总含量之比)；(4)采用真核表达系统，不需要进行蛋白质的复性。本专利技术所制备的CD3抗原可以用于抗CD3抗体的筛选和分析，以及作为相关检测试剂盒的原料。本专利技术的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。【专利附图】【附图说明】通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中:图1为本专利技术所提供的CD3抗原的结构示意图图2为重组载体pcDNA3.1 (+)Hygro 一 Q)3E_Fcw的质粒图谱图3为重组载体pcDNA3.1 (+)Hygro 一 Q)3G_Fcw的质粒图谱图4为重组载体pcDNA3.1 (+)Hygro 一 Q)3D_Fcw的质粒图谱图5为用Western Blot方法对本专利技术所提供的抗原进行检测的结果图图6为用6%SDS_PAGE检测本专利技术⑶3抗原的纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD3抗原，其特征在于所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述Fc片段由Fc1片段和Fc2片段通过二硫键形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端与Fc1的N端连接，构成融合蛋白CD3E?ECD?Fc1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3D?ECD?Fc2，或者CD3G?ECD的C端与Fc2的N端连接，构成融合蛋白CD3G?ECD?Fc2；其中，Fc1片段和Fc2片段的氨基酸序列均为将SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列进行2个或3个氨基酸的点突变获得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张敬，王瑞，刘杨，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：