【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纤连蛋白结合结构域嵌合抗原受体及其使用方法相关申请本申请要求2017年6月16日提交的美国临时专利申请序列号62/521,095的优先权，其内容通过引用并入本文。
技术介绍
基于支架的结合蛋白在其结合特定配体靶标的能力方面是抗体的合法替代品。基于支架的结合蛋白包括衍生自完整的人类纤连蛋白III型(FN3)结构域的那些。FN3结构域首先被识别为是纤连蛋白蛋白中的重复结构域之一。FN3结构域构成小的(～94个氨基酸)单体β三明治蛋白，其由具有三个连接环的7条β链组成。FN3的N端附近的三个环在功能上类似于免疫球蛋白结构域的互补决定区。衍生自完整人FN3结构域的基于支架的结合蛋白质是小的(常规单克隆抗体的1/15的大小)，具有高稳定性，并具有对靶抗原的高亲和力和选择性。参见例如Cappuccilli等(美国专利号8,680,019)。嵌合抗原受体(CAR)已被广泛研究用于治疗多种癌症。使用表达CAR的细胞(例如CAR-T细胞)的免疫疗法是非常有前途的治疗方法，具有根除肿瘤细胞的潜力。尽管在特定的实施方式中细胞疗法是用于癌症，包括涉及实体瘤和血液恶性肿瘤的癌症，但是这样的疗法可以适用于任何医学状况。当前的CAR分子是基于scFv的使用，scFv是具有免疫原性问题的大蛋白。另外，由于scFv结构的不稳定性和灵活性，VH/VL结构域通过框架区域相互作用而交换和多聚体形成的可能性，不正确的折叠问题，和由聚集引起的问题，scFv的使用与异常信号传导相关。这样，当前的CAR-T策略受到诸如严重患者副作用和响应持久性不良的困扰。例如，使用基于...
【技术保护点】
1.一种用于与靶抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：/ni)包含纤连蛋白3型(FN3)结构域多肽的至少一个抗原特异性靶向区；/nii)跨膜结构域；和/niii)胞内信号传导结构域。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170616 US 62/521,0951.一种用于与靶抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
i)包含纤连蛋白3型(FN3)结构域多肽的至少一个抗原特异性靶向区；
ii)跨膜结构域；和
iii)胞内信号传导结构域。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述FN3结构域多肽包含：
a)具有选定的天然纤连蛋白3型多肽的野生型氨基酸序列的区域A，AB，B，C，CD，D，E，EF，F和G，和
b)具有选定的氨基酸长度的环区域BC，DE和FG。
3.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中BC环的长度为11、14或15个氨基酸。
4.权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中DE环的长度为6个氨基酸。
5.权利要求1至4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中FG环的长度为8或11个氨基酸。
6.权利要求1至5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述FN3结构域多肽包含人纤连蛋白的第14纤连蛋白3型模块。
7.权利要求1至5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述FN3结构域多肽包含人纤连蛋白的第10纤连蛋白3型模块。
8.权利要求1至7中任一项所述的嵌合抗原受体，其进一步包含胞外间隔结构域。
9.权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外间隔结构域选自抗体的Fc片段，抗体的铰链区，抗体的CH2区，抗体的CH3区，人工间隔序列，包含CD8的氨基酸序列的铰链，及其任何组合。
10.权利要求1至9中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个抗原特异性靶向区演化自野生型抗原特异性靶向区，并且具有以下中的至少一者：
a)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低；和
b)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
11.权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中与所述野生型抗原特异性靶向区相比，所述至少一个抗原特异性靶向区在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低。
12.权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中与所述野生型抗原特异性靶向区相比，所述至少一个抗原特异性靶向区在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
13.权利要求10至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个抗原特异性靶向区具有以下两者：a)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低，和b)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
14.权利要求10至13中任一项所述的嵌合抗原受体，其中与包含所述野生型抗原特异性靶向区的相同嵌合抗原受体相比，所述嵌合抗原受体的表达水平增加。
15.权利要求10至14中任一项所述的嵌合抗原受体，其中与在正常生理条件下相比，所述胞外间隔结构域在异常生理条件下具有增强的泛素化抗性水平。
16.权利要求10至15中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述生理条件选自：
温度；
pH；
渗透压；
渗透度；
氧化应激
电解质浓度；
葡萄糖、乳酸、丙酮酸盐、营养组分、代谢物、氧、碳酸盐、磷酸盐、或二氧化碳的浓度；
细胞类型；和
营养可得性。
17.权利要求10至16中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述生理条件是温度，并且其中所述抗原特异性靶向区在正常生理温度下基本上无活性，并且在低于所述正常生理温度的异常生理温度下有活性。
18.权利要求1至17中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域选自人工疏水序列和以下中的跨膜结构域：I型跨膜蛋白，T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。
19.权利要求1至18中任一项所述的嵌合抗原受体，其进一步包含至少一个共刺激结构域。
20.权利要求19所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个共刺激结构域选自以下中的共刺激结构域：TNFR超家族中的蛋白，CD28，4-1BB(CD137)，OX40(CD134)，PD-1，CD7，LIGHT，CD83L，DAP10，DAP12，CD27，CD2，CD5，ICAM-1，LFA-1，Lck，TNFR-I，TNFR-II，Fas，CD30，CD40，ICOS，NKG2C和B7-H3。
21.权利要求1至20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域选自以下中的胞质信号传导结构域：人CD3ζ链，FcγRIII，FcsRI，Fc受体的细胞质尾，具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体，TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。
22.权利要求1至21中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个抗原特异性靶向区结合选自以下的靶抗原：AGR2，AIG1，AKAP1，AKAP2，ANGPT1，ANGPT2，ANGPTL3，ANGPTL4，ANPEP，APC，APOC1，AR，AZGP1(锌-α-糖蛋白)，BAD，BAG1，BAI1，BCL2，BMP6，BPAG1，BRC1A，BRCA1，CANT1，CAV1，CCL11，CCL2，CCNA1，CCNA2，CCND1，CCNE1，CCNE2，CD138，CD164，CD19，CD20，CD22，CD3，CD4，CD44，CD52，CD8，CDH1(E-钙黏蛋白)，CDH10，CDH12，CDH13，CDH18，CDH19，CDH20，CDH5，CDH7，CDH8，CDH9，CDK2，CDK3，CDK4，CDK5，CDK6，CDK7，CDK9，CDKN1A(p21Wap1/Cip1)，CDKN1B(p27Kip1)，CDKN1C，CDKN2A(p16INK4A)，CDKN2B，CDKN2C，CDKN3，CEA，CHGA，CHGB，CLDN3，CLDN7(claudin-7)，CLN3，CLU(簇集素)，COL18A1，COL1A1，COL4A3，COL6A1，CTNNB1(β-连环蛋白)，CTSB(组织蛋白酶)，CXCL1，CXCL10，CXCL3，CXCL5，CXCL6，CXCL9，CYB5，CYC1，DAP2IP，DES，DNCL1，E2F1，ECGF1，EDG1，EFNA1，EFNA3，EFNB2，EGF，EGFR，EGFRvIII，ELAC2，ENG，ENO1，ENO2，ENO3，EPHB4，ERBB2(Her-2)，EREG，ERK8，ESR1，ESR2，F3(TF)，FAP，FASN，FGF1，FGF10，FGF11，FGF12，FGF13，FGF14，FGF16，FGF17，FGF18，FGF19，FGF2，FGF20，FGF21，FGF22，FGF23，FGF3，FGF4，FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9，FGFR3，FIGF，FLJ12584，FLJ25530，FLRT1(纤连蛋白)，FLT1，FOSL1(FRA-1)，GABRP(GABA-A)，GAGEB1，GAGEC1，GATA3，GD2，GGT1，GNAS1，GNRH1，GPC3，GRP，GSN(凝溶胶蛋白)，GSTP1，HGF，HGFR(MET)，HIP1，HUMCYT2A，ID2，IFNA1，IFNB1，IFNG，IGF1，IGF1R，IGF2，IGFBP2，IGFBP3，IGFBP6，Igκ轻链，IL12A，IL13RA2，IL1A，IL1B，IL2，IL24，IL29，IL2RA，IL3RA(CD123)，IL6，IL6R，IL6ST(糖蛋白130)，IL8，ILK，INHA，INSL3，INSL4，ITGA1，ITGA6(α6整联蛋白)，ITGAV，ITGB3，ITGB4(β4整联蛋白)，JAG1，JUN，K6HF，KAII，KDR，KLF5(GCBoxBP)，KLK10，KLK12，KLK13，KLK14，KLK15，KLK3，KLK4，KLK5，KLK6，KLK9，KRT1，KRT19，KRT2A，KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)，LAMA5，Lewis-Y，MACMARCKS，MAP2K7(c-Jun)，MDK，MIB1，MKI67(Ki-67)，MMP2，MMP9，MSLN(间皮素)，MSMB，MT3(金属硫蛋白-3)，MTSS1，MUC1(黏蛋白)，MUC16，MYC，NGFB(NGF)，NGFR，NKG2D配体，NME1(NM23A)，NOX5，NR0B1，NR0B2，NR1D1，NR1D2，NR1H2，NR1H3，NR1H4，NR1I2，NR1I3，NR2C1，NR2C2，NR2E1，NR2E3，NR2F1，NR2F2，NR2F6，NR3C1，NR3C2，NR4A1，NR4A2，NR4A3，NR5A1，NR5A2，NR6A1，NRP1，NRP2，NTN4，ODZ1，P1AS2，P1K3CG，PAP，PART1，PATE，PAWR，PCA3，PCNA，PDGFA，PECAM1，PF4，PGF，PGR，PLAU(UPA)，网蛋白，PLG，PLXDC1，PPID，PR1，PRKCQ，PRKD1，PRL，PROK2，PSAP，PSCA，PSMA，PTEN，PTGS2(COX-2)，RAC2(p21-Rac2)，RARB，ROBO2，ROR-1，S100A2，SCGB1D2(亲脂素B)，SCGB2A1(乳腺珠蛋白-2)，SCGB2A2(乳腺珠蛋白-1)，SERPINA3，SERPINB5(乳腺丝抑蛋白)，SERPINE1(PAI-1)，SERPINF1，SHBG，SHBQ，SLC2A2，SLC33A1，SLC43A1，SPRR1B(Spr1)，STAB1，STEAP，STEAP2，TEK，TGFA，TGFB1，TGFB111，TGFB1I1，TGFB2，TGFB3，TGFBR1，TGRA，THBS1(血小板反应蛋白-1)，THBS2，THBS4，TIE(Tie-1)，TIMP3，TNF，TNFAIP2(B94)，TNFRSF6(Fas)，TNFRSF7(BCMA)，TNFRSF8(CD30)，TNFSF10，TNFSF6(FasL)，TOP2A(拓扑异构酶-2α)，TP53，TPM1，TPM2，TRPC6，VEGF，VEGFC，及其任何组合。
23.权利要求1至22中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个抗原特异性靶向区结合选自以下的靶抗原：CD19，CD20，CD22，Igκ轻链，TNFRSF8(CD30)，CD138，TNFRSF7(BCMA)，CD33，IL3RA(CD123)，NKG2D配体，ROR1，EGFR，EGFRvIII，GD2，IL13RA2，ERBB2(Her-2)，MSLN(间皮素)，PSMA，FAP，GPC3，HGFR(MET)，MUC16，CEA，Lewis-Y，MUC1及其任何组合。
24.一种用于与靶抗原结合的多特异性嵌合抗原受体，其包含：
i)至少两个抗原特异性靶向区，其中所述抗原特异性靶向区中的一个或多个包括FN3结构域多肽；
ii)跨膜结构域；和
iii)胞内信号传导结构域。
25.权利要求24所述的多特异性嵌合抗原受体，其中每个FN3结构域多肽包含：
a)具有选定的天然纤连蛋白3型多肽的野生型氨基酸序列的区域A，AB，B，C，CD，D，E，EF，F和G，和
b)具有选定的氨基酸长度的环区域BC，DE和FG。
26.权利要求24或25所述的多特异性嵌合抗原受体，其中每个FN3结构域多肽的BC环的长度为11、14或15个氨基酸。
27.权利要求24至26中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中每个FN3结构域多肽的DE环的长度为6个氨基酸。
28.权利要求24至27中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中每个FN3结构域多肽的FG环的长度为8或11个氨基酸。
29.权利要求24至28中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述FN3结构域多肽包含人纤连蛋白的第14纤连蛋白3型模块。
30.权利要求24至28中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述FN3结构域多肽包含人纤连蛋白的第10纤连蛋白3型模块。
31.权利要求24至30中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其进一步包含胞外间隔结构域。
32.权利要求31所述的多特异性嵌合抗原受体，其中与在正常生理条件下相比，所述胞外间隔结构域在异常生理条件下具有增强的泛素化抗性水平。
33.权利要求24至32中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述至少两个抗原特异性靶向区通过接头连接。
34.权利要求33所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述接头衍生自天然纤连蛋白序列。
35.权利要求34所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述天然纤连蛋白序列是第14FN3结构域的末端与第15FN3结构域的BC环之间的序列。
36.权利要求33至35中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述接头包含序列AIDAPSNLRFLATTPNSLLV(SEQIDNO:21)。
37.权利要求33至36中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述接头包含序列AIDAPSNLRFLATT(SEQIDNO:22)。
38.权利要求35所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述接头是条件性接头，所述条件性接头在异常生理条件下具有第一构象用于所述至少两个抗原特异性靶向区以比所述条件性接头在正常生理条件下的第二构象的结合活性更高的结合活性结合所述靶抗原。
39.权利要求24至38中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述至少两个抗原特异性靶向区中的至少一个演化自野生型抗原特异性靶向区，并且具有以下中的至少一者：
a)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低；和
b)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
40.权利要求39所述的多特异性嵌合抗原受体，其中与所述野生型抗原特异性靶向区相比，所述至少两个抗原特异性靶向区中的至少一个在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低。
41.权利要求39所述的多特异性嵌合抗原受体，其中与所述野生型抗原特异性靶向区相比，所述至少两个抗原特异性靶向区中的至少一个在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
42.权利要求39至41中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述至少两个抗原特异性靶向区中的至少一个具有以下两者：a)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在正常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性降低，和b)与所述野生型抗原特异性靶向区相比，在异常生理条件下在测定中与所述靶抗原结合的活性增加。
43.权利要求39至42中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中与包含所述野生型抗原特异性靶向区的相同嵌合抗原受体相比，所述嵌合抗原受体的表达水平增加。
44.权利要求39至43中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述生理条件选自：
温度；
pH；
渗透压；
渗透度；
氧化应激
电解质浓度；
葡萄糖、乳酸、丙酮酸盐、营养组分、代谢物、氧、碳酸盐、磷酸盐、或二氧化碳的浓度；
细胞类型；和
营养可得性。
45.权利要求44所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述生理条件是温度，并且其中所述抗原特异性靶向区在正常生理温度下基本上无活性，并且在低于所述正常生理温度的异常生理温度下有活性。
46.权利要求24至45中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域选自以下中的胞质信号传导结构域：人CD3ζ链，FcγRIII，FcsRI，Fc受体的细胞质尾，具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞质受体，TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，和CD66d。
47.权利要求24至46中任一项所述的多特异性嵌合抗原受体，所述至少一个抗原特异性靶向区结合选自以下的靶抗原：AGR2，AIG1，AKAP1，AKAP2，ANGPT1，ANGPT2，ANGPTL3，ANGPTL4，ANPEP，APC，APOC1，AR，AZGP1(锌-α-糖蛋白)，BAD，BAG1，BAI1，BCL2，BMP6，BPAG1，BRC1A，BRCA1，CANT1，CAV1，CCL11，CCL2，CCNA1，CCNA2，CCND1，CCNE1，CCNE2，CD138，CD164，CD19，CD20，CD22，CD3，CD4，CD44，CD52，CD8，CDH1(E-钙黏蛋白)，CDH10，CDH12，CDH13，CDH18，CDH19，CDH20，CDH5，CDH...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·科雷，尹俊，C·A·霍坎森，E·扎克，
申请(专利权)人：普罗特利卡公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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