一种热休克转录因子1显性负效应突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn‑Hsf1及其应用，属于生物技术领域。通过同源比对人类和黄曲霉（

A dominant negative effect mutant of heat shock transcription factor 1 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种热休克转录因子1显性负效应突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种热休克转录因子1显性负效应突变体及其应用。
技术介绍
真菌是一类广泛分布于自然界的真核生物，对人类的生活有益处也有坏处。许多真菌为我们提供了食物来源，作为发酵工业和食品加工业的重要菌种，它们所产生的多种次级代谢产物在工业生产和医学上具有重要应用价值。也有许多真菌对人类的健康和社会经济造成极大危害。不少真菌，如烟曲霉（Aspergillusfumigatus）和白念珠菌（Cadidaalbicans），能够侵染人体，造成局部组织器官或全身性的真菌感染甚至死亡。许多真菌还可以寄生于动植物及其加工制品中，并产生剧毒的真菌毒素污染，严重危害人畜健康，如黄曲霉和寄生曲霉（Aspergillusparaciticus）能够产生黄曲霉毒素，镰刀菌（Fusariumgraminearum）能够产生伏马毒素和呕吐毒素，烟曲霉能产生胶霉毒素。我国每年因农产品及其制品被真菌毒素污染而造成的损失巨大。因此，如果能做到提前干预，防止或降低真菌污染，不仅能有效的减少农业和食品加工业的损失，也能够更好的保障食品安全和公共健康，具有重大的社会和经济意义。自然界中,热休克反应是一种广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的机体保护机制，其主要作用是在生长发育过程中以及各种应激条件下调控机体内相关基因的转录表达，起到防御和保护机体的作用。哺乳动物的热休克转录因子1（HeatShocktranscriptionFactor1，HSF1）是细胞热休克蛋白表达的主要调控因子。HSF1可以被热应激、氧化压力、化学刺激和生理应激等激活，形成同源三聚体结合到热休克蛋白启动子区的热休克元件上，调控导热休克蛋白合成。HSF1不仅能够调节热休克蛋白的表达,而且能调控多药耐药基因MDR1的表达。在人肝癌细胞中的研究表明，HSF1的活化促进HepG2细胞的阿霉素耐药性。白念珠菌和大豆疫霉（Phytophthorasojae）的HSF1也与菌株的致病性相关。在哺乳动物中表达具有显性负效应的突变体dn-cHSF1可抑制正常HSF1在体内发挥功能。然而，目前还未有利用真菌的Hsf1显性负效应突变体来防控真菌污染的应用。因此本专利技术构建一种真菌来源的Hsf1显性负效应突变体dn-Hsf1来抑制正常Hsf1在真菌体内发挥功能，从而抑制真菌的生长、达到防控真菌污染的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种热休克转录因子1显性负效应突变体及其应用。将黄曲霉Hsf1蛋白C末端的第576位至第788位共213个氨基酸残基删除获得黄曲霉中热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1。该显性负效应突变体dn-Hsf1能抑制正常Hsf1在真菌体内发挥功能，从而抑制真菌的生长，在防控真菌污染方面具有广阔应用前景。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1：（1）所述dn-Hsf1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；或（2）具有（1）所限定的序列，但在上述序列之外通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有（1）所限定的dn-Hsf1的功能的由（1）衍生的dn-Hsf1。优选的氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸为1-20个或1-15或1-3个或1个。更优选的，缺失如SEQIDNO.1所示氨基酸序列中第364位至第378位共15个氨基酸残基。优选的，所述dn-Hsf1来源于黄曲霉（Aspergillusflavus）。在进一步优选的实施方式中，所述dn-Hsf1的氨基酸序列与SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。在第二方面，本专利技术提供第一方面所述的dn-Hsf1的编码核苷酸序列。优选的，所述的dn-Hsf1的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在第三方面，本专利技术提供包含第一方面所述的dn-Hsf1的编码核苷酸序列的表达载体。上述包含dn-Hsf1的编码核苷酸序列的表达载体的构建方法为：以黄曲霉NRRL3357菌株基因组DNA为模板，PCR扩增Hsf1自身启动子Phsf1和Hsf1终止子Thsf1的核苷酸片段；以黄曲霉NRRL3357菌株cDNA为模板扩增dn-Hsf1编码核苷酸片段dn-hsf1；将Phsf1、dn-hsf1、和Thsf1共3个片段用融合PCR法连接到一起构建包含hsf1自身启动子Phsf1、dn-hsf1编码核苷酸和Hsf1终止子终止子Thsf1的融合核苷酸片段Phsf1-dn-hsf1-Thsf1，并将其插入pPTRI载体中，经转化，筛选阳性转化子，测序验证，获得表达载体质粒pPTRI-dn-hsf1。在第四方面，本专利技术提供包含第一方面所述的dn-Hsf1的编码核苷酸序列的融合核苷酸片段。所述包含dn-Hsf1的编码核苷酸序列的融合核苷酸片段的构建方法：以黄曲霉NRRL3357菌株基因组DNA为模板，PCR的扩增dn-Hsf1上游重组片段up；从烟曲霉AF293菌株基因组DNA中用PCR的方法扩增pyrG筛选标记基因片段；从产黄青霉NRRL1951菌株基因组DNA中用PCR扩增木糖诱导启动子PxylP片段；从质粒pPTRI-dn-hsf1中用PCR法扩增约dn-hsf1-Thsf1核苷酸片段；将上游重组片段up、pyrG筛选标记基因片段、木糖诱导启动子PxylP片段和dn-hsf1-Thsf1核苷酸片段，共4个片段用融合PCR法连接到一起构建融合核苷酸片段up-pyrG-PxylP-dn-hsf1-Thsf1。上述表达载体及融合核苷酸片段的构建中所用引物序列见表1.表1引物序列表在第五方面，本专利技术提供第一方面所述的dn-Hsf1、或第二方面所述编码核苷酸序列、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述融合核苷酸片段在防控真菌污染方面的应用。将热休克转录因子1Hsf1显性负效应突变体dn-Hsf1；或者热休克转录因子1Hsf1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列；或者携带热休克转录因子1Hsf1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列的载体，或者热休克转录因子1Hsf1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列的融合核苷酸片段导入真菌细胞中，使真菌细胞表达dn-Hsf1，抑制细胞内正常的Hsf1发挥功能，抑制真菌的生长。本专利技术的应用和优点：（1）本专利技术提供了一种来源于真菌的dn-Hsf1，与人源的dn-cHSF1的同源性很低，该dn-Hsf1能抑制真菌、特别是霉菌的生长；（2）本专利技术提供的dn-Hsf1能够抑制真菌细胞内正常Hsf1的功能，进而抑制真菌的生长，因此dn-Hsf1在应用时无需考虑真菌细胞自身的hsf1基因是否存在以及存在的拷贝数；（3）使用本专利技术提供的dn-Hsf1来抑制真菌的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1，其特征在于：/n（1） 所述dn-Hsf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或/n（2） 具有（1）所限定的序列，但在上述序列之外通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有（1）所限定的功能的由（1）衍生的dn-Hsf1。/n

【技术特征摘要】
1.一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1，其特征在于：
（1）所述dn-Hsf1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；或
（2）具有（1）所限定的序列，但在上述序列之外通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有（1）所限定的功能的由（1）衍生的dn-Hsf1。


2.根据权利要求1所述的一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1，其特征在于：如SEQIDNO.1所示氨基酸序列中氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸为1-20个或1-15或1-3个或1个。


3.根据权利要求2所述的一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1，其特征在于：如SEQIDNO.1所示氨基酸序列中缺失第364位至第378位共15个氨基酸残基。


4.如权利要求1所述一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列。


5.根据权利要求4所述一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


6.包含权利要求1所述一种热休克转录因子1显性负效应突变体dn-Hsf1的编码核苷酸序列的表达载体。


7.如权利要求6所述表达载体的构建方法，其特征在于：以黄曲霉NRRL3357菌株基因组DNA为模板，PCR扩增Hsf1自身启动子Phsf1和Hsf1终止子的核苷酸片段Thsf1；以黄曲霉NRRL3357菌株cDNA为模板扩增dn-Hsf1编码核苷酸片段dn-hsf1...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂鑫怡，王银春，李博文，张轶，薛杨，王佳琪，张双焘，汪世华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35