一种荧光微球与抗体的偶联方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种荧光微球与抗体的偶联方法，包括如下步骤：(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物；本发明专利技术上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。

A coupling method of fluorescent microspheres and antibodies

【技术实现步骤摘要】
一种荧光微球与抗体的偶联方法
本专利技术实施例涉及生物分析
，具体涉及一种荧光微球与抗体的偶联方法。
技术介绍
对某些抗原或特异性蛋白进行检测时,通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体蛋白上,通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或抗体的性质和含量的技术。目前常用的标记物包括胶体金、乳胶、荧光素、荧光微球、酶和放射性核素等。然而，现有的荧光微球标记抗体过程中，由于标记方法不合适，导致荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低，从而导致荧光强度交底的问题。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，以解决现有技术中由于标记方法不合适，导致荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面提供一种荧光微球与抗体的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。本专利技术上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。进一步地，所述荧光微球表面含有羧基，可以是红色荧光微球、绿色荧光微球、量子点荧光微球或时间分辨荧光微球；优选地，所述荧光微球粒径80-500nm。进一步地，所述抗体蛋白为肌酸激酶同工酶单克隆抗体。本专利技术通过对荧光微球和抗体蛋白种类的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。进一步地，所述步骤(a)中，活化处理具体为：将荧光微球清洗后进行超声分散、稀释，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的荧光微球。进一步地，所述稀释采用的稀释剂为含聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液，聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05-2％，稀释后的荧光微球固含量为0.8-1.2‰。进一步地，所述含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶(22-28)；所述含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；所述含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml。进一步地，所述常温反应时间为25-35min。本专利技术通过上述特定的活化方法，能够充分提高荧光微球的活性，提高与抗体的偶联强度和偶联效率。进一步地，所述步骤(a)中，重悬为向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理即可。进一步地，所述步骤(a)中，微球悬浮液中荧光微球的固含量为0.08-0.12％。进一步地，所述步骤(b)中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶(180-220)；抗体溶液中抗体浓度为2.8-3.0mg/ml。本专利技术通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的灵敏度。进一步地，所述步骤(b)中，反应时间为50-70min；超声处理时间为55-65s，超声波频率为40KHZ；继续反应时间为55-65min。进一步地，所述步骤(c)中，封闭液为20％的BSA，且添加后的反应液中BSA浓度为0.4-0.6％；封闭时间为55-65min。进一步地，所述步骤(d)中，甘氨酸溶液中甘氨酸浓度为4.5-5.5％。本专利技术实施例具有如下优点：(1)本专利技术上述偶联方法，通过对荧光微球进行活化处理，以及通过超声处理保障各反应物的充分接触，能够显著提高荧光微球与抗体的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与抗体蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生。(2)本专利技术通过对荧光微球和抗体蛋白种类的限定，能够更好地提高荧光微球与抗体蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。(3)本专利技术通过控制抗体与荧光微球的添加量，能够使得抗体与荧光微球充分结合，并具有较佳的空间构象，避免抗体蛋白活性的降低，影响荧光检测的灵敏度。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例为一种荧光微球与肌酸激酶同工酶单克隆抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：(a)将荧光微球清洗后进行超声分散3min、采用聚乙烯吡咯烷酮浓度为2％的MES缓冲液进行稀释至荧光微球固含量为0.8‰，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应25min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集活化后的荧光微球，向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液、超声处理，得到荧光微球的固含量为0.08％的微球悬浮液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶28含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为12mg/ml；(b)将浓度为3.0mg/ml的抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应50min、采用40KHZ的超声波超声处理65s、继续反应65min，其中，抗体溶液与微球悬浮液的体积比1∶180；(c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA至反应液中BSA浓度为0.4％进行封闭反应65min、以10000r/min离心10min，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于浓度为4.5％的甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。实施例2本实施例为一种荧光微球与肌酸激酶同工酶单克隆抗体的偶联方法，该偶联方法包括如下步骤：(a)将荧光微球清洗后进行超声分散2min、采用聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05％的MES缓冲液进行稀释至荧光微球固含量为1.2‰，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应35min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集活化后的荧光微球，向活化处理后的荧光微球中添加含0.2％聚乙烯吡咯烷酮的ME本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；/n(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；/n(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；/n(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将荧光微球进行活化处理、重悬，得到微球悬浮液；
(b)将抗体溶液添加至微球悬浮液中进行反应、超声处理、继续反应；
(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光微球与抗体偶联的复合物。


2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤(a)中，活化处理具体为：
将荧光微球清洗后进行超声分散、稀释，随后依次向稀释后的荧光微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的荧光微球。


3.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述稀释采用的稀释剂为含聚乙烯吡咯烷酮的MES缓冲液，聚乙烯吡咯烷酮浓度为0.05-2％，稀释后的荧光微球固含量为0.8-1.2‰。


4.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光微球溶液的体积比均为1∶(22-28)；所述含有NHS的乙醇溶液中NH...

【专利技术属性】
技术研发人员：管静波，赵树民，孙如，石松传，郭波，
申请(专利权)人：北京博肽未名生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11