一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法，包括如下步骤：将荧光乳胶微球进行活化处理、重悬，得到荧光乳胶微球溶液；采用甘氨酸溶液稀释蛋白，然后加入到荧光乳胶微球溶液中，超声反应，之后旋转混匀反应，甘氨酸和蛋白进行共标记；待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光乳胶微球与蛋白偶联的复合物；该偶联方法能够提高荧光乳胶微球与蛋白的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。

A coupling method of fluorescent latex microspheres and proteins

【技术实现步骤摘要】
一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法
本专利技术实施例涉及生物分析
，具体涉及一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法。
技术介绍
对某些抗原或特异性蛋白进行检测时,通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体蛋白上,通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或抗体的性质和含量的技术。目前常用的标记物包括胶体金、乳胶、荧光素、荧光微球、酶和放射性核素等。然而，现有的荧光微球标记抗体过程中，由于标记方法不合理，荧光微球与抗体偶联效率和偶联强度较低导致检测荧光值偏低。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法，以解决现有技术中荧光微球与蛋白偶联效率和偶联强度较低，导致检测卡荧光值偏低问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面提供一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：(a)将荧光乳胶微球进行活化处理、重悬，得到荧光乳胶微球溶液；(b)采用甘氨酸溶液稀释蛋白，然后加入到荧光乳胶微球溶液中，超声条反应，之后旋转混匀反应，甘氨酸和蛋白进行共标记；(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光乳胶微球与蛋白偶联的复合物；本专利技术上述偶联方法，通过对荧光乳胶微球进行活化处理，以及采用特定的缓冲液以及超声、旋转反应处理，能够显著提高荧光乳胶微球的活化效果以及促进荧光乳胶微球与蛋白充分接触，进而提高荧光乳胶微球与蛋白的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与蛋白的结合位点充分结合，能够有效提高制备复合物的稳定性，并避免凝集现象的发生；此外，还能够提高荧光检测的灵敏度。进一步地，所述步骤(a)中，超声反应时间为8-12min。进一步地，所述蛋白为心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。本专利技术通过对蛋白种类的限定，能够更好地提高荧光乳胶微球与蛋白的偶联效率和偶联强度，提高免疫荧光的检测效果。进一步地，所述步骤(b)中，荧光乳胶微球溶液与含有蛋白的甘氨酸溶液的体积比为1∶(3-5)。进一步地，所述甘氨酸溶液浓度为0.01-0.2mM。进一步地，所述蛋白的添加至终浓度为20-200ug/ml。进一步地，所述活化处理为：将荧光乳胶微球进行稀释，随后依次向稀释后的荧光乳胶微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的荧光乳胶微球。进一步地，所述稀释为采用MES缓冲液将荧光乳胶微球稀释至固含量为0.8-1.2‰；所述含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光乳胶微球溶液的体积比均为1∶(22-28)；所述含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8-12mg/ml；所述含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为8-12mg/ml。进一步地，所述步骤(d)中，超声分散至分散系数PDI≤0.07；优选地，超声分散的功率为100W、分散时间为1min，期间工作3s，间歇3s。进一步地，所述步骤(c)中，封闭液为20％的BSA，且添加后的反应液中BSA浓度为0.4-0.6％；封闭时间为55-65min。进一步地，所述步骤(d)中，甘氨酸溶液中甘氨酸浓度为4.5-5.5％。本专利技术实施例具有如下优点：(1)本专利技术上述偶联方法，通过对荧光乳胶微球进行活化处理，以及采用特定的缓冲液以及超声、旋转反应处理，能够显著提高荧光乳胶微球的活化效果以及促进荧光乳胶微球与蛋白充分接触，进而提高荧光乳胶微球与蛋白的偶联效率以及偶联强度，使得微球表面与蛋白的结合位点充分结合，提高荧光检测的荧光强度。(2)本专利技术通过EDC的添加，能够显著提高荧光乳胶微球的活性，能够促进荧光乳胶微球与蛋白的结合以及提高结合强度，并提高稳定性。(3)本专利技术通过控制蛋白的添加量使得蛋白与荧光乳胶微球具有较佳的空间构象，避免降低蛋白活性。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例为一种荧光乳胶微球与心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：(a)采用MES缓冲液将荧光乳胶微球稀释至固含量为0.8‰；随后依次向稀释后的荧光乳胶微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应25min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集收集活化后的荧光乳胶微球，添加MES缓冲液、超声处理，得到荧光乳胶微球的固含量为0.08％的荧光乳胶微球溶液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光乳胶微球溶液的体积比均为1∶26；含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为10mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为10mg/ml；(b)将17μL浓度为3.0mg/ml的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，采用0.05mM甘氨酸溶液稀释至300μL，加入到荧光乳胶微球溶液中，在40KHZ超声下反应10min，继续旋转混匀反应65min，进行甘氨酸和心肌肌钙蛋白I单克隆抗体共标记，其中，荧光乳胶微球溶液与含有心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的甘氨酸溶液的体积比为1∶4；(c)待反应结束后，向反应液中添加20％的BSA封闭液，且添加后的反应液中BSA浓度为0.5％；封闭时间为60min，以13000r/min离心20min，收集沉淀物；(d)将沉淀物置于浓度为5％的甘氨酸溶液中、以超声分散的功率为100W、期间工作3s，间歇3s，超声分散至分散系数PDI≤0.07，即得荧光乳胶微球与心肌肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的复合物。实施例2本实施例为一种荧光乳胶微球与心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的偶联方法，所述偶联方法包括如下步骤：(a)采用MES缓冲液将荧光乳胶微球稀释至固含量为0.8‰；随后依次向稀释后的荧光乳胶微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应25min、超声处理、以10000r/min离心10min，收集收集活化后的荧光乳胶微球，添加MES缓冲液、超声处理，得到荧光乳胶微球的固含量为0.08％的荧光乳胶微球溶液，其中，含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液的添加量分别与荧光乳胶微球溶液的体积比均为1∶28；含有NHS的乙醇溶液中NHS的浓度为8mg/ml；含有EDC的乙醇溶液中EDC的浓度为12mg/ml；(b)将17μL浓度为3.0mg/ml的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，采用0.05mM甘氨酸溶液稀释至300μL，加入到荧光乳胶微球溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)将荧光乳胶微球进行活化处理、重悬，得到荧光乳胶微球溶液；/n(b)采用甘氨酸溶液稀释蛋白，然后加入到荧光乳胶微球溶液中，超声反应，之后旋转混匀反应，甘氨酸和蛋白进行共标记；/n(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；/n(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光乳胶微球与蛋白偶联的复合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光乳胶微球与蛋白的偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将荧光乳胶微球进行活化处理、重悬，得到荧光乳胶微球溶液；
(b)采用甘氨酸溶液稀释蛋白，然后加入到荧光乳胶微球溶液中，超声反应，之后旋转混匀反应，甘氨酸和蛋白进行共标记；
(c)待反应结束后，向反应液中添加封闭液进行封闭、离心，收集沉淀物；
(d)将沉淀物置于甘氨酸溶液中、超声分散，即得荧光乳胶微球与蛋白偶联的复合物。


2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述蛋白为心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。


3.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述甘氨酸溶液浓度为0.01-0.2mM。


4.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述活化处理为：将荧光乳胶微球进行稀释，随后依次向稀释后的荧光乳胶微球溶液中添加含有NHS的乙醇溶液和含有EDC的乙醇溶液、混匀、常温反应、超声处理、离心，收集活化后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：管静波，赵树民，孙如，石松传，郭波，
申请(专利权)人：北京博肽未名生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11