光触发病毒疗法的远端控制制造技术

铁化病毒粒子，例如可带有如KillerRed蛋白质的光敏剂的铁化腺相关病毒粒子，及其用于光触发的抗肿瘤病毒疗法。

Remote control of light triggered virus therapy

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光触发病毒疗法的远端控制相关申请案的交叉引用本案主张于2016年11月4日提交的美国临时申请案62/417,946的权益，其内容通过引用整体并入本文中。
技术介绍
在癌症的创新性治疗中，病毒疗法是一种具潜能的癌症治疗剂，目前正在临床试验中评估几个不同病毒科的病毒(Belletal.,CellHostMicrobe,2014；Russelletal.,Nat.Biotechnol.,2012；Miestetal.,Nat.Rev.Microbiol.,2014)。在大多数病毒疗法的临床试验中，病人通过肿瘤内注射来进行病毒疗法(Miestetal.,Nat.Rev.Microbiol.,2014)。于癌症治疗中，强化病毒的全身性传递仍为有效病毒疗法的一个障碍(Ledford,Nature,2015；Belletal.,CellHostMicrobe,2014；Russelletal.,Nat.Biotechnol.,2012；Miestetal.,Nat.Rev.Microbiol.,2014；Kottermanetal.,Nat.Rev.Genet.,2014)。因此，实现有效且准确的全身性传递将大幅扩展病毒疗法的机会。涉及腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导的基因递送的临床试验已使许多单基因疾病的治疗(Kottermanetal.,Nat.Rev.Genet.,2014；Naldini,Nature,2015)及组织工程的发展(Yooetal.,Adv.Healthc.Mater.,2016)能够成功。定向定位降低了治疗剂量，因此也降低了AAV导向的免疫反应、异位表达及导致基因突变的致癌基因活化的风险。而且，设计AAV壳体(Lisowskietal.,Nature,2014)及从AAV基因体中消除CpG基序(Faustetal.,J.Clin.Invest.,2013)的改进方法已借由使其避免与因人类自然暴露于AAV所产生的中和抗体结合，进而降低了AAV的免疫原性。有趣的是，AAV壳体被设计以表达光依赖性因子基序，该光依赖性因子基序结合于经核定位序列标记的光可切换式蛋白质，当在暴露于光时，该AAV壳体显示显著增加的基因递送效率(Gomezetal.,ACSNano.,2016)。但是，准确并特定地递送合适剂量的遗传物质一直是主要的挑战。对于全身性的通过身体血液循环给药病毒，肝脏通常为预设的目的地(Kottermanetal.,Nat.Rev.Genet.,2014)，且当其它器官/组织为预期靶标时则代表屏障。
技术实现思路
本公开至少部分地基于磁性病毒粒子的发展，举例而言，带有光敏剂蛋白质(如：KillerRed蛋白质)的铁化病毒粒子，其成功地定位于被施加磁场的部位。当用于光触发病毒疗法时，此种铁化AAV2粒子成功地降低肿瘤的生长。据此，本公开的一方面特征为磁性病毒粒子(如：铁化病毒粒子)，包含与磁氧化纳米粒子(如：氧化铁纳米粒子)缀合的病毒粒子。该磁氧化粒子可具有从1至100nm的直径范围。于一些情况下，该磁氧化粒子可具有5nm的平均直径。于一些具体实施例中，该病毒粒子是腺相关病毒(AAV)粒子，举例而言，血清型1至9中的任一型(如：AAV2)粒子、慢病毒粒子或腺病毒粒子。于一些具体实施例中，本文所述的磁性病毒粒子中的任一者可带有例如KillerRed蛋白质的光敏剂蛋白质，其可包含SEQIDNo：1的氨基酸序列。另一方面，本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包含：(i)对有需要的受试者给药有效量的本文所述的磁性病毒粒子，其中，该磁性病毒粒子带有光敏剂，例如KillerRed蛋白质；(ii)对受试者的肿瘤部位施加磁场，以诱导磁性病毒粒子定位于肿瘤部位；以及(iii)于步骤(ii)之后，对受试者的肿瘤部位执行光照射。于一些具体实施例中，步骤(iii)以波长540至580nm(如：561nm)执行。或者或是此外，该肿瘤部位位于肺、肾、心脏、膀胱、皮肤、乳房或肠道。再一方面，本公开提供一种制备磁性病毒粒子的方法，例如本文所述的铁化病毒粒子，其中，该方法包含在一种或多种交联剂的存在下，将磁氧化纳米粒子(如：氧化铁纳米粒子)化学缀合于病毒粒子。于一些具体实施例中，该化学缀合涉及乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导的缀合。于一些实施例中，本文所述的制备方法包含：(i)在羧基活化剂的存在下，将诸如氧化铁纳米粒子的磁氧化纳米粒子与羧酸混合，以形成混合物；(ii)将能够使羧基转化成胺反应性NHS酯的试剂置入该混合物中，以形成经该胺反应性NHS酯修饰的磁氧化纳米粒子；以及(iii)将该经修饰的磁氧化纳米粒子与病毒粒子培养，以形成该磁性病毒粒子。该羧基活化剂可为碳二亚胺化合物，如：EDC。或者或是此外，在步骤(ii)的试剂为N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。另外，本公开的范围内还包括(i)用于治疗肿瘤的医药组合物，其中该医药组合物包含本文所述的任一磁性病毒粒子及医药上可接受的载体；以及(ii)该磁性病毒粒子用于制备治疗肿瘤的药剂的用途。本专利技术的一或多个具体实施例的细节阐述于下。本专利技术的其它特征或优点将从下述附图、具体实施例，以及所附权利要求书的详细描述中为显而易见。附图说明图1包括显示远端控制“铁化”病毒的示意图。图1A：借由单次尾静脉注射进行微病毒疗法的远端定向铁化病毒的概念。当铁化AAV2经磁场强制定向递送时，迅速累积于标的肿瘤部位。此处，KillerRed由受AAV2-KillerRed感染的肿瘤细胞表达。光启动了病毒疗法。对KillerRed蛋白质的照射产生ROS及随后的细胞内损伤，促使细胞死亡。图1B：利用涉及EDC/Sulfo-NHS的两阶段缀合方法，将铁化AAV2与氧化铁纳米粒子缀合的例示性方法的示意图。照片显示铁化AAV2的透明黄色溶液。图1C：具有羧酸的氧化铁纳米粒子的TEM图像。比例尺＝50nm。图1D：以纳米粒子/EDC的摩尔比(1/20)所制备的铁化AAV2展现氧化铁纳米粒子与病毒相关联的TEM图像。比例尺＝200nm。图1E：借由流式细胞术分析经不同摩尔比的纳米粒子/EDC与铁化AAV2转导6天后GFP-表达细胞的百分比(#,P>0.25；##,P<0.005；基于双尾t检定，假设变异数不相等)。数据显示重复六次测量的平均值±s.d.。图1F：HEK293细胞暴露于不同摩尔比的纳米粒子/EDC的铁化AAV2后的存活率。细胞存活率由与未暴露的细胞相比较，处理24小时后所剩余的活细胞的百分比而获得。细胞数目借由标准MTS分析法测定(*,P>0.2；**,P>0.5；基于双尾t检定，假设变异数不相等)。数据显示重复六次测量的平均值±s.d.。图2包括显示微转导的远端控制“铁化”病毒的照片及图表。图2A：于磁场暴露期间(5、10或30分钟)，AAV2分布的代表性共焦图像，借由使用抗AAV2抗体及缀合至Alexa488的二级抗体进行免疫染色。图2B：将磁化30分钟且未修饰的AA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁性病毒粒子，包含与磁氧化纳米粒子缀合的病毒粒子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161104 US 62/417,9461.一种磁性病毒粒子，包含与磁氧化纳米粒子缀合的病毒粒子。


2.如权利要求1所述的磁性病毒粒子，为包含与氧化铁纳米粒子缀合的所述病毒粒子的铁化病毒粒子。


3.如权利要求1或2所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述磁氧化纳米粒子具有从1至100nm的直径范围。


4.如权利要求3所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述磁氧化纳米粒子具有5nm的平均直径。


5.如权利要求1至4任一项所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子是腺相关病毒(AAV)粒子、慢病毒粒子或腺病毒粒子。


6.如权利要求5所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子是AAV粒子，且是AAV血清型1至9中的任一种。


7.如权利要求1至6任一项所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述病毒粒子包含光敏剂。


8.如权利要求7所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述光敏剂包含KillerRed蛋白质。


9.如权利要求8所述的磁性病毒粒子，其特征在于，所述KillerRed蛋白质包含SEQIDNO：1的氨基酸序列。


10.一种治疗肿瘤的方法，包含：
(i)对有需要的受试者投予有效量的如权利要求1至9任一项所述的磁性病毒粒子，其中所述铁化病毒粒子带有光敏剂；
(ii)对所述受试者的肿瘤部位施加磁场，以诱导所述磁性病毒粒子定位于所述肿瘤部位；以及
(iii)于步骤(ii)后，对所述受试者的所述肿瘤部位执行光照射。


11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(iii)以540至580nm的波长执行。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨泮池，曾士杰，廖子娴，
申请(专利权)人：中央研究院，杨泮池，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71