Fuchs角膜内皮营养不良基因TCF4的CTG重复快速筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种快速筛查Fuchs角膜内皮营养不良高风险基因TCF4的CTG重复扩增的检测方法及其试剂盒。Fuchs角膜内皮营养不良在40岁以上欧美人群发生率为5％，其中约70％患者存在TCF4的CTG重复扩增。试剂盒成分包括DNA聚合酶、反应溶液、增强剂、dNTPs、特异引物和标准品对照。通过高CG含量PCR体系，高热稳定性DNA聚合酶扩增CTG重复经荧光扫描后，与标准品比较可准确区分待测样品的CTG重复所在区间。本发明专利技术的试剂盒适用于各年龄段个人或大样本量快速筛查Fuchs角膜内皮营养不良位点TCF4的CTG重复数目属于正常还是扩增范畴，从而为高风险人群提起制定各阶段有效治疗策略，对角膜移植供体进行筛选。试剂盒具有准确、快速、高通量、样本量少、价廉的特点。

CTG repeat rapid screening kit for Fuchs corneal endothelial dystrophy gene Tcf4

【技术实现步骤摘要】
Fuchs角膜内皮营养不良基因TCF4的CTG重复快速筛查试剂盒
本专利技术涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种快速筛查Fuchs角膜内皮营养不良风险基因TCF4的三号内含子中CTG重复数目的方法及试剂盒。
技术介绍
Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchsendothelialcornealdystrophy，FECD)，又称为滴状角膜，是角膜内皮进行性的损伤，角膜后弹力层增厚，细胞外基质赘疣沉积，最终发展成为角膜内皮失代偿为特征的遗传性角膜疾病。Fuchs角膜内皮营养不良是角膜移植最主要的原因，40岁以上的美国人约有5％患有此病。特征性表现为角膜滴状赘疣的形成、角膜后弹力层局限性增厚、角膜内皮细胞密度及离子转运功能不断下降。当所剩角膜内皮细胞的数目很少而致内皮功能失代偿时，角膜基质和上皮水肿引起视力下降，逐渐发展为大泡性角膜病变，最终可能导致失明。大约70％Fuchs角膜内皮营养不良患者含有TCF4的重复序列扩增，而且含有CTG重复扩增的患者表型更严重，这一扩增将使患病风险增加30倍以上。这一重复扩增不但在欧美人群发生率很高，在亚洲人群发生率也很高。通常40岁之前发病较少，女性与男性患病率约为2.5-3∶1，FECD的临床进程通常为10至20年，角膜移植是目前挽救患者视力的惟一方法，与没有CTG重复扩增的Fuchs角膜内皮营养不良患者相比，含有CTG重复扩增的患者约55.3％会接受角膜移植，可能性高1.6倍。含有CTG重复扩增患者平均中心角膜厚度为605.9微米，没有CTG扩增的则为581.3微米。角膜移植风险包括急性和慢性的排斥反应、角膜内皮移植失败、感染和伤及眼睛等。大多数移植后受体视力仅能达到20/20，需要六个月恢复期，患者需要在术后需要连续使用至少两年的免疫抑制剂滴眼液，长期使用易患白内障或青光眼。Fuchs角膜内皮营养不良最高发的遗传因子为TCF4三号内含子的CTG重复扩增。CTG重复数目小于或等于37为正常，在37-52之间表明与Fuchs角膜内皮营养不良相关，超过52为Fuchs角膜内皮营养不良高风险。研究发现Fuchs角膜内皮营养不良患者TCF4的mCTG转录子和MBNL1的核内包涵体主要积累在角膜内皮，这一CTG重复扩增会引起TCF4RNA的聚集，捕获关键RNA剪切因子，造成一系列关键分子差异性剪切，从而导致广泛的基因表达谱改变，最终导致细胞死亡。与其他重复扩增疾病类似，在患者的角膜内皮也存在非AUG起始翻译造成的细胞毒性。TCF4突变也与原发硬化性胆管炎和精神分裂症相关。对于不同年龄阶段人群(包括婴儿、儿童、青少年、年轻人或中老年)均可进行该检测，从而确定是否为Fuchs角膜内皮营养不良高风险。Fuchs角膜内皮营养不良临床高风险可以在I期无明显症状时就积极进行干预，当发生角膜水肿时可使用高渗滴眼液或高渗软膏，例如睡前可使用5％氯化钠眼膏来增加泪液渗透压，使角膜上皮脱水，减轻清晨时眼部症状，必要时配合局部消炎抗感染药物。鉴定出的Fuchs角膜内皮营养不良高风险者可提早与医生选择眼睛治疗方案，减少错误操作。在激光原位角膜磨镶术、屈光性角膜切削术或不同类型的激光屈光术之前，可以评估受试者是否存在Fuchs角膜内皮营养不良高发风险。如果受试者存在该高发风险，则应避免选择以上治疗方案，因为这将增加将来治疗的复杂性并在角膜移植后带来副作用。准备通过眼内手术矫正近视、远视和散光的人应进行该检测是否存在Fuchs角膜内皮营养不良高发风险，因为眼内手术会加速角膜内皮细胞的减少。眼内手术矫正近视、远视和散光包括去除和跟换天然晶状体，以及在已有晶状体上再移植一个晶状体从而保持原有晶状体的完整。该检测鉴定出Fuchs角膜内皮营养不良高风险还有助于帮助角膜库避免这种高风险的捐赠者。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良致病基因TCF4三号内含子的CTG重复扩增的试剂盒，从而区分Fuchs角膜内皮营养不良高风险。为了实现专利技术目的，我们采用了以下技术方案：设计一高CG含量PCR扩增体系，包括选择热启动的超高热稳定性的DNA聚合酶，设计特异引物，优化出独特的PCR体系增强剂，增加50个CTG重复的标准品对照以准确区分CTG正常和扩增样本。本专利技术提供了用于检测Fuchs角膜内皮营养不良致病基因TCF4的CTG重复数目的PCR试剂盒，包括DNA聚合酶、反应溶液、增强剂、dNTPs、特异引物和标准品对照。本专利技术的引物包括：用于检测CTG重复数目PCR系统I反应体系的引物TCF4-F1、TCF4-R1，及用于检测扩增的CTG重复的PCR系统II反应体系引物TCF4-T1、TCF4-TGC7、TCF4-R2、TCF4-F2、TCF4-T2和TCF4-GCA7。所述PCR系统I反应体系上游引物TCF4-F1核苷酸序列为SEQIDN0：1，下游引物TCF4-R1的核苷酸序列为SEQIDNO：2。所述PCR系统II反应体系中，针对CTG重复序列的上游引物为TCF4-T1和TCF4-TGC7，引物TCF4-T1为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为SEQIDN0：3，引物TCF4-TGC7包含5’端的与TCF4-T1相同的序列和7个TGC三核苷酸重复，其核苷酸序列为SEQIDNO：4；下游引物TCF4-R2核苷酸序列为SEQIDNO：5。所述PCR系统II反应体系中，针对CTG重复序列的上游引物为TCF4-F2，其核苷酸序列为SEQIDNO：6；下游引物为TCF4-T2和TCF4-GCA7，TCF4-T2为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为SEQIDNO：7，引物TCF4-GCA7包含5’端的与TCF4-T2相同的序列和7个GCA三核苷酸重复，其核苷酸序列为SEQIDNO：8。以上引物信息详见下表表1：表1引物序列信息SEQIDNO：1TCF4-F1CCTAAACCAAGTCCCAGACATGTSEQIDNO：2TCF4-R1TGGCAAAACTTCCGAAAGCCATTTCSEQIDNO：3TCF4-T1GTGGCATGCCAGTATTGAGACGSEQIDNO：4TCF4-TGC7GTGGCATGCCAGTATTGAGACGTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCSEQIDNO：5TCF4-R2CAAAAGAAGGTCTAGAAGAGGAGGSEQIDNO：6TCF4-F2GAGAATGAATTCATTTTTAATGCSEQIDNO：7TCF4-T2CAGTAAACAGCTATGACCATTSEQIDNO：8TCF4-GCA7CAGTAAACAGCTATGACCATTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物，其包括用于扩增包含CTG重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，用于扩增CTG重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合，以及用于扩增CTG重复区域和3’侧翼区的区域的第二引物组合。/n

【技术特征摘要】
20180929 CN 20181114544001.引物，其包括用于扩增包含CTG重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，用于扩增CTG重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合，以及用于扩增CTG重复区域和3’侧翼区的区域的第二引物组合。


2.根据权利要求1的引物，其中用于扩增包含CTG重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对中上游引物TCF4-F1序列包含SEQIDNO：1，下游引物TCF4-R1序列包含SEQIDNO：2。


3.根据权利要求1或2的引物，其中用于扩增CTG重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合中针对CTG重复序列的上游引物为TCF4-T1和TCF4-TGC7，TCF4-T1序列包含SEQIDNO：3，TCF4-TGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：金赟懿，
申请(专利权)人：杭州方夏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33