神经元核内包涵体病NOTCH2NLC基因GGC重复扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种快速检测NOTCH2NLC基因GGC重复异常扩增的方法及试剂盒。试剂盒成分包括反应溶液、增强剂、特异引物、dNTPs和DNA聚合酶。通过高GC含量PCR体系，GGC重复经高热稳定性和高GC含量模板的DNA聚合酶扩增并进行荧光扫描即可计算出待测样品的GGC重复数目和判断是否发生扩增。本发明专利技术的试剂盒通过PCR系统1检测NOTCH2NLC基因GGC的重复数目，确定重复数目属于正常还是突变范围，筛查出受试者是否携带GGC致病突变；通过PCR系统2的梯形峰判断是否存在扩增，避免漏检。该方法可应用于神经元核内包涵体病和部分痴呆患者的基因检测。本试剂盒具有快速、准确、灵敏度高、防漏检等特点。

【技术实现步骤摘要】
神经元核内包涵体病NOTCH2NLC基因GGC重复扩增检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学诊断领域,具体涉及一种检测神经元核内包涵体病NOTCH2NLC基因GGC重复扩增的方法及试剂盒。
技术介绍
神经元核内包涵体病(NeuronalIntranuclearInclusionDisease，NIID)是以中枢和外周神经系统以及内脏器官内嗜酸性透明包涵体为特征的一种罕见的多系统慢性进展的神经退行性疾病。NIID的临床表现具有高度异质性，取决于神经元丢失的主要部位而定，主要包括锥体系和锥体外系症状、小脑性共济失调、痴呆、痫性发作、周围神经病和自主神经功能障碍等。多数少年发病，少数中年发病，家族性常见。一般发病10-20年后死亡。第一例NIID由Lindenderg等人在1968年报道，1例精神发育迟缓、进行性痉挛、共济失调的男性患者，脑和内脏细胞发现核内包涵体。后续欧美和日本等地相继报道了NIID100余例，发病年龄从婴儿、少年、成年至68岁。NIID的临床表型异质性非常高,主要表现痴呆、自主神经、周围神经、锥体外系、小脑以及精神行为异常等症状。以往确证需要通过尸检、直肠活检、神经活检等，现在主要通过皮肤活检是否存在嗜酸性核内包涵体来确诊。影像学检查DWI的特征性皮质-髓质交界处高信号可疑诊为NIID。目前该病尚无明确规范的诊断标准，皮肤活检显示嗜酸性核内包涵体即为确诊。但由于患者配合度等原因，诊断困难，非常容易发生漏诊和误诊。NOTCH2NLC位于1q21.1，是人类特有的三个NOTCH2NL基因(NOTCH2NLA、NOTCH2NLB和NOTCH2NLC)其中之一。它在包括神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的多种神经细胞中高度表达。NOTCH2NL基因参与了人类大脑皮层的快速进化，解释了人类与其他灵长类动物相比大脑皮层扩增的原因。NOTCH2NL基因间具有极高度的序列相似性，且多为GC-rich区域，二代测序发等方法很难进行序列进行分析和检测。NOTCH2NLC基因(NM_001364012)的5’UTR区域存在一段GGC的重复序列，正常人不会发生扩增，但是神经元核内包涵体病患者均存在GGC重复序列的扩增。正常人GGC重复数目几乎都小于40,目前检测到致病的最低GGC重复数为66个。最新研究表明家族性和散发的NIID都是由于NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增引起的，还有一部分痴呆患者也可能是由于该基因的GGC重复异常扩增引起。对于神经元核内包涵体病，基因检测势必将取代皮肤活检成为诊断金标准。对于多核苷酸重复的检测方法通常为直接对多核苷酸重复片段进行PCR扩增，随后利用毛细管电泳对扩增片段长度进行检测，从而确定核苷酸重复的数目。但是NIID患者NOTCH2NLC的GGC重复扩增数高，普通PCR难以检测这种大片段且高GC含量的动态突变。Southernblot虽然可以用于较大片段重复序列的检测，但是实验需要较多高质量DNA，且实验技术复杂、成本高、周期长，很难在临床上推广应用。异常扩增片段长且GC含量高，需要特异的方法进行检测。由于高GC序列扩增的困难性，实验室难以进行该检测，也没有公司推出相应产品，如果操作不当，极易发生误诊或漏诊。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测NOTCH2NLC基因GGC重复数目的试剂盒。为了实现专利技术目的，我们采用了以下技术方案：设计一套高GC含量PCR扩增体系，包括设计特异引物，选择热稳定性和针对高GC含量模板的DNA聚合酶，优化出独特的PCR体系增强剂。本专利技术提供了用于检测NOTCH2NLC基因GGC重复数目的PCR试剂盒，包括特异引物、反应溶液、增强剂、DNA聚合酶、dNTPs。本专利技术的引物包括：用于检测GGC重复数目PCR系统1反应体系的引物NOTCH2NLC-F、NOTCH2NLC-R，及用于判断扩增的GGC重复是否扩增的PCR系统2反应体系引物NOTCH2NLC-T、NOTCH2NLC-GGC5和NOTCH2NLC-R2。所述PCR系统1反应体系上游引物NOTCH2NLC-F核苷酸序列为SEQIDNO:1，下游引物NOTCH2NLC-R的核苷酸序列为SEQIDNO:2。所述PCR系统2反应体系中，针对GGC重复序列的上游引物为NOTCH2NLC-T和NOTCH2NLC-(GGC)5，引物NOTCH2NLC-T为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为SEQIDNO:3，引物NOTCH2NLC-GGC5包含5’端的与NOTCH2NLC-T相同的序列和5个GGC核苷酸重复，其核苷酸序列为SEQIDNO:4；下游引物NOTCH2NLC-R2核苷酸序列为SEQIDNO:5。以上引物信息详见下表表1：表1引物序列信息本专利技术还提出了一种针对高CG含量PCR体系的增强剂，其成分包括DMSO和1,2-丙二醇。本专利技术采用的检测设备需要区分样本的尺寸范围，可采用安捷伦2100生物分析仪，毛细管电泳ABI3130、3500、3730不同系列均可。PCR体系中热稳定性的DNA聚合酶可以是：DNAploymerasefromExpandTMLongTemplatePCRSystem(Roche)、DyNAzymeEXTDNAPolymerase(ThermoFisherScientific)、TaqDNAPolymerase(ThermoFisherScientific)和DeepDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs公司)等，但不限制在以上种类的热稳定性DNA聚合酶。本专利技术采用热稳定性且适合高GC含量的DNA聚合酶扩增GGC重复，PCR扩增后的产物进行毛细管电泳，根据产物尺寸利用公式计算即可确定待测样品的GGC重复数目。本专利技术所需生物样本可以来源于人的各种组织、细胞系以及血液或体液。用来检测NOTCH2NLC基因GGC重复数目的DNA可选择以上来源的样本提取的基因组DNA。NOTCH2NLC基因GGC重复扩增是神经元核内包涵体病最主要的致病基因，本专利技术的试剂盒用于GGC重复数目的检测，确定重复数目属于正常还是致病突变范围，该方法可应用于神经元核内包涵体病的基因检测。试剂盒具有快速、高通量、样本量少、价格低的特点，且PCR系统2可以判断是否存在扩增，克服了PCR系统1的扩增长度限制，因此可有效避免漏检。附图说明图1：PCR系统1筛查GGC重复扩增结果图。图2：PCR系统2筛查GGC重复扩增结果图。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐述本专利技术。但是应该理解，所述实施例只是用于举例说明的目的，并不意欲限制本专利技术的范围和精神。实施例1：制备NOTCH2NLC基因GGC重复快速筛查试剂盒1、引物设计在NOTCH2NLC基因GGC重复序列上游5’端和下游3’端200bp内设计一对PCR系统Ⅰ特异上游引物NOTCH2NLC-F和下游引物NOTCH2NLC-R，扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物，其包括用于扩增包含GGC重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，用于扩增GGC重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合，以及用于扩增GGC重复区域和3’侧翼区的区域的第二引物组合。/n

【技术特征摘要】
1.引物，其包括用于扩增包含GGC重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，用于扩增GGC重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合，以及用于扩增GGC重复区域和3’侧翼区的区域的第二引物组合。


2.根据权利要求1的引物，其中用于扩增包含GGC重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对中上游引物NOTCH2NLC-F序列包含SEQIDNO:1，下游引物NOTCH2NLC-R序列包含SEQIDNO:2。


3.根据权利要求1或2的引物，其中用于扩增GGC重复区域和5’侧翼区的区域的第一引物组合中针对GGC重复序列的上游引物为NOTCH2NLC-T和NOTCH2NL...

【专利技术属性】
技术研发人员：段然慧，唐北沙，金赟懿，
申请(专利权)人：杭州方夏生物科技有限公司，唐北沙，
类型：发明
国别省市：浙江;33