一种可基因编码的人工光合作用蛋白质及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种可基因编码的人工光合作用蛋白质及其应用。具体地，本发明专利技术人通过遗传密码子扩展在超折叠黄色荧光蛋白sfYFP第66位掺入二苯甲酮‑丙氨酸BpA，并经过进一步的遗传密码扩展得到一系列可基因编码的人工光敏蛋白PSP，如SEQ ID NOs：2、4、6、8、10所示。通过对包含单个半胱氨酸的PSP突变体进行特异性三联吡啶镍(II)配合物修饰，得到具有光催化活性的缀合物。所述PSP突变体被光敏后具有提高的衰减寿命，该过程能够模拟天然光合作用系统吸收光能，并进而催化二氧化碳还原。

An artificial photosynthetic protein with gene encoding and its application

【技术实现步骤摘要】
一种可基因编码的人工光合作用蛋白质及其应用
本专利技术提供一种可基因编码的人工光合作用蛋白质及其应用。具体地，本专利技术提供的可基因编码的人工光合蛋白质能够模拟天然光合作用系统吸收光能，催化二氧化碳还原成一氧化碳。
技术介绍
近年来，开发高效的二氧化碳固定方法以应对逐年升高的大气二氧化碳浓度，已经成为化学研究领域的重点问题。其中，植物的光合作用系统作为一种天然的解决方案，因其清洁，自组装，高效的光致电荷分离效率等优势受到广泛关注。然而，相比化学小分子催化剂，天然光合作用系统的二氧化碳还原效率相对低下。并且，天然光合作用系统由复杂的膜蛋白亚基和多种辅酶组成，这给研究和实际应用带来了不便。光合作用是地球上最重要的过程，其将太阳能转化成化学能，并将二氧化碳(CO2)转化为生物量1-4。目前，研究者对于如何提高光合作用效率并重复利用光系统推动挑战性的化学转化具有极大的兴趣，然而，这存在显著的技术挑战5-12。首先，由于天然光合系统由大量的膜蛋白、酶和辅因子组成，因此想从基因上改造光合作用机制是非常难的；其次，尽管光系统I和光系统II能够共同作用将NADP+还原为NADPH(E0＝-320mV，相对于标准的氢电极(standardhydrogenelectrode，SHE)，所有还原电势都相对于SHE)，然而，NADPH由于还原力较低，从而不能促进二氧化碳(CO2)到一氧化碳(CO)的直接还原(E0＝-520mV)。
技术实现思路
专利技术简述为解决这些问题，本申请人一直致力于应用合成生物学方法，开发可基因编码的人工光合作用系统，使其兼具天然光系统和化学小分子催化剂的优势。这种人工设计的光合蛋白质不仅可以为研究二氧化碳还原方法提供新思路，也为进化具有非天然光催化活性的人工生命体提供基础。光敏剂能够利用光能使弱还原剂变为强还原剂，因而其是天然和人工光合作用机制中的关键成分。在本申请中，专利技术人从改造光敏蛋白入手，克服了现有技术中的种种限制，合理设计了一种可基因编码的人工光敏蛋白(photosensitizersprotein，PSP)和一种光敏CO2还原酶，所述光敏CO2还原酶通过将PSP特定位点(例如第95位)突变成半胱氨酸，然后在该位点特异性缀合三联吡啶镍(II)配合物(例如，N-(2，6，2-三联吡啶-4-基)-碘乙酰胺修饰后加入镍离子)而得到。本专利技术人通过遗传密码扩展，在超折叠黄色荧光蛋白(superfolderyellowfluorescentprotein，sfYFP，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示)第66位掺入二苯甲酮-丙氨酸(BpA)，并经过进一步的遗传密码扩展得到一系列可基因编码的人工光敏蛋白(PSP)。在PSP的基础上，本专利技术人进一步引入其他特异性氨基酸残基突变，从而在PSP上特异性缀合三联吡啶镍(II)配合物，得到具有光催化二氧化碳生成一氧化碳的活性的蛋白缀合物，将其称为光催化性二氧化碳还原酶(PSP295CterpyridineNi(II)，简称为PSP2T)。PSP2T的分子量仅为27kD，其可以通过在体外用三联吡啶镍(II)配合物化学修饰遗传表达的PSP蛋白而制备。PSP2T在水/DMF溶液中起作用，不需要贵金属，CO2/CO转化量子效率(conversionquantumefficiency)为2.6％，远高于在相似条件下使用纳米晶体或小分子光敏剂的大多数光催化剂的CO2/CO转化量子效率3。除了PSP2T的简单性之外，本专利技术人在对PSP2T的研究中受到启发，并且了解了复杂的光合作用机制的实质：可见光吸收，强还原力的产生，和二氧化碳还原。在光吸收时，PSP被有效地转化为寿命较长的三重态激发态PSP*(long-livedtripletexcitedstatePSP*)，进一步的电子传递使弱还原力(如具有较弱还原力的NADH)提高，产生还原力大大增强的超还原剂PSP·(E0＜-1.14V)。实验表明，在没有光激发情况下，EuDTPA(Europium(II)Diethylenetriaminepentaaceticacid，二乙烯三氨基乙酸铕(II))不能将PSP还原为自由基状态，EuDTPA具有非常低的还原电势，其标准还原电势为E0＝-1.14V。接着，本专利技术人解析了PSP·的晶体结构，该晶体结构为使用PSP·促进新型酶反应提供了必需的原子结构信息。重要的是，本专利技术人通过研究证明了对PSP2T活性重要的三个变量可以通过诱变方便地且独立地进行优化，从而产生显著提高的二氧化碳还原活性。第一，可以微调发色团的光化学特性，使其光激发态具有充足的氧化性，能够氧化弱牺牲还原剂(sacrificialreductant，SR)，从而产生可用于推动二氧化碳还原催化剂的还原的强还原基团；第二，可以微调发色团与催化中心之间的距离，从而促进从发色团到催化中心的连续电子转移步骤，并且同时防止不利的电荷重组步骤(detrimentalchargerecombinationstep)；第三，由于二氧化碳还原需要电子和质子，可以微调催化中心的微环境，从而优化质子和电子的转移。然而，通过改造天然的光合作用系统、纳米晶体或小分子光敏剂难以实现对上述三个变量的容易且独立的优化。因此，本专利技术人的工作代表有希望的光氧还酶设计新途径，能够提供研究蛋白上的多种电子/质子转移的重要模型，并且在可再生能量、二氧化碳利用、温室气体排放减少和光氧还催化剂中具有广泛应用。专利技术详述本专利技术人在前期研究中发现，一种分子量仅为约27kD的荧光蛋白具有改造为类似天然光系统的光合蛋白质的潜能。首先，研究发现该荧光蛋白受光激发后，其发色团可以生成具有高还原活性的中间体，这种中间体可以高效率的向位于蛋白质β折叠桶外的电子受体传递电子。此外，应用基因密码子扩展技术，专利技术人可以特异性的插入非天然氨基酸，从而取代原组成发色团中的酪氨酸。这使得研究人员可以理性设计荧光蛋白的荧光发色团化学结构，优化其吸收光谱、激发态寿命、自由基还原电势等一系列光化学性质。设计基于荧光蛋白突变体的高效二氧化碳光还原蛋白质的核心问题在于如何延长其发色团受激发后所生成的还原性中间态的寿命，和降低它的还原电势。在本专利技术中，专利技术人选择了一种带有二苯甲酮取代基的酪氨酸类似物(BpA)来改造发色团。二苯甲酮是一种有机光催化中常用的光敏剂。当它受到一定波长的光照射时，其激发态会系间穿越为寿命较长的三重态。这种三重态进而和牺牲还原剂反应生成高活性的自由基态，催化下游氧化还原反应。使用密码子扩展方法插入BpA改造荧光蛋白的发色团后，其新生成的荧光蛋白(PSP)保留了这种特性。应用瞬态吸收光谱的研究表明，受光激发后，插入BpA的新发色团可以几乎全部转化为三重态；在有牺牲还原剂(例如抗坏血酸)的存在下，三重态中间体等价于快速氧化牺牲还原剂，从而生成自由基态。该自由基被蛋白质骨架保护，因此在没有氧气存在的条件下可以稳定存在10分钟以上。另一方面，针对发色团小分子类似物的电化学分析表明，所生成的单电子还原态具有接近-1.5V的还原电势。这不仅满足了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可基因编码的人工光合作用蛋白质，其通过遗传密码子扩展，在超折叠黄色荧光蛋白sfYFP第66位氨基酸位点掺入二苯甲酮-丙氨酸BpA而得到，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种可基因编码的人工光合作用蛋白质，其通过遗传密码子扩展，在超折叠黄色荧光蛋白sfYFP第66位氨基酸位点掺入二苯甲酮-丙氨酸BpA而得到，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


2.权利要求1所述的人工光合作用蛋白质，其还包含Tyr203Phe突变，氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。


3.权利要求1所述的人工光合作用蛋白质，其还包含Tyr203Asp和His148Glu突变，氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。


4.权利要求3所述的人工光合作用蛋白质，其中所述蛋白质的三重激发态的衰减寿命为123μs。


5.权利要求3所述的人工光合作用蛋白质，其还包含Glu95Cys突变，氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，刘晓红，康福英，胡诚，汪莉，许震，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11