一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用制造技术

一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用。本发明专利技术从大麦麦芽中纯化得到一种大麦麦芽内源木聚糖酶的竞争型抑制蛋白。经鉴定该蛋白为大麦α‑淀粉酶/枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(barleyα‑amylase/subtilisin inhibitor，BASI)。BASI的发现，可以解释阿拉伯木聚糖在糖化过程中未被降解的原因，还可作为筛选因子，用于筛选啤酒糖化工艺条件下，对BASI不敏感，对大麦麦芽高分子量阿拉伯木聚糖具有高效降解能力的微生物木聚糖酶，这对于降低麦汁和啤酒中高分子量阿拉伯木聚糖的含量和提高啤酒的生产效率具有重要意义。

A protein with the ability to inhibit the endogenous xylanase activity of barley malt and its application

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用
本专利技术涉及一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白及其应用，属于啤酒生产

技术介绍
啤酒糖化生产中，糖化醪液经过滤槽分离而得到透明澄清的麦汁，糖化醪液中麦汁的分离速度即过滤速度。麦汁的过滤速度是酿酒师最为重视的指标之一，其决定了啤酒生产过程的效率。大麦麦芽是啤酒酿造的主要原料，阿拉伯木聚糖是大麦麦芽胚乳细胞壁的主要成分，在实际生产过程发现，由于高含量的阿拉伯木聚糖影响了麦汁的过滤速度。高分子量的阿拉伯木聚糖水溶液具有较高的粘度，致使糖化的粘度高，大麦麦芽的过滤速度慢，同时醪液的高粘度不利于酶与底物的接触，导致蛋白和淀粉等大分子物质降解不充分，浸出物收得率较低，降低了啤酒的生产效率，增加了生产成本。研究表明，在整个糖化过程中都可以检测到大麦麦芽内源木聚糖酶的活性，但醪液中的阿拉伯木聚糖含量却始终保持在一个相对稳定的值，即大麦麦芽内源木聚糖酶无法降解阿拉伯木聚糖。推测可能是大麦中存在某种抑制内源木聚糖酶活力的物质。内源木聚糖酶抑制剂能够阻碍木聚糖酶发挥作用，降低木聚糖酶的催化效率，使木聚糖酶无法有效的降解阿拉伯木聚糖。目前关于大麦麦芽中木聚糖酶抑制剂研究的相关文献相对较少，仅Goesaert等《Purificationandpartialcharacterizationofanendoxylanaseinhibitorfrombarley》(CerealChemistry,2001,78(4):33-41)利用离子交换和凝胶过滤色谱从大麦中纯化到一种对部分微生物(Asperillusaculeatus、Aspergillusniger、Bacillussubtilis、Trichodermaviride和Rumenmicroorganism)分泌的木聚糖酶具有抑制作用的蛋白，该抑制剂是一种分子量为40.0kDa的蛋白，且该论文未研究其得到的蛋白对大麦内源木聚糖酶是否具有抑制活性，无法解释在糖化过程中大麦麦芽内源木聚糖酶未能降解阿拉伯木聚糖的现象。目前还没有文献报道大麦麦芽中是否存在对内源性木聚糖酶有抑制作用的抑制剂。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活力的蛋白——大麦α-淀粉酶/枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(barleyα-amylase/subtilisininhibitor，BASI)及其应用，该抑制蛋白的存在解释了大麦麦芽糖化过程中高分子量阿拉伯木聚糖未能降解的原因；同时，为能在啤酒糖化工艺中最终降解高分子量阿拉伯木聚糖，该抑制蛋白可用于筛选对大麦麦芽内源木聚糖酶抑制剂具有抗性的微生物木聚糖酶，这类微生物木聚糖酶能够高效降解糖化醪液中的高分子量阿拉伯木聚糖，这对于提高微生物木聚糖酶的应用效果及啤酒生产效率均有重要意义。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种蛋白质在抑制木聚糖酶活力中的应用，所述蛋白NCBI登录号：1210227A，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述木聚糖酶为大麦麦芽内源木聚糖酶。在本专利技术的一种实施方式中，将所述的蛋白质以摩尔比2～4:1的比例加入至含木聚糖酶的环境中，于30～40℃反应25～35min。本专利技术提供了一种筛选对木聚糖酶抑制因子具有抗性的木聚糖酶的方法。在本专利技术的一种实施方式中，以所述蛋白质作为抑制剂，加入至含有待筛选的木聚糖酶的反应体系中，于30～40℃反应25-35min，残余酶活相对高的为对权利要求1所述的蛋白质有抗性的木聚糖酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述筛选方法包括以下步骤：以终浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖为底物，加入权利要求1所述的蛋白质和待筛选的木聚糖酶溶液在35-40℃下反应28～35mim，测定木聚糖酶的残余活性。在本专利技术的一种实施方式中，测定木聚糖酶的方法为DNS比色法。在本专利技术的一种实施方式中，反应是在乙酸-乙酸钠缓冲液中进行。本专利技术提供了一种氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的BASI蛋白的制备方法。在本专利技术的一种实施方式中，所述BASI蛋白制备步骤包括：(1)大麦麦芽中水溶性蛋白的提取；(2)脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分的初步分离；(3)离子交换柱对水溶性蛋白的分离；(4)凝胶层析柱纯化。本专利技术提供了一种大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白BASI的制备方法，所述BASI蛋白的制备步骤包括：(1)利用含L-抗坏血酸与乙酸-乙酸钠缓冲溶液对大麦麦芽中水溶性蛋白进行提取，离心后取上清；(2)利用脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分进行初步分离；(3)利用离子交换柱对水溶性蛋白组分再次分离，收集洗脱液；(4)将洗脱液进行凝胶层析柱纯化。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中使用乙酸-乙酸钠缓冲液，步骤(2)中所述脱盐柱为SephadexG-25。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中的离子交换柱为DEAESepharoseFastFlow，步骤(4)中所述凝胶层析柱为SephacrylS-100，并使用PEG20000包埋浓缩收集的具有抑制活性的组分。有益效果：本专利技术提供了一种具有抑制大麦麦芽内源木聚糖酶活性的蛋白(BASI)，通过调节BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比，使得该抑制蛋白对大麦麦芽内源木聚糖酶的抑制率最大可达81％。大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的存在解释了大麦麦芽糖化过程中高分子量阿拉伯木聚糖未能降解的原因，同时该抑制蛋白可用于筛选对大麦麦芽内源木聚糖酶抑制剂具有抗性微生物木聚糖酶，筛选得到的微生物木聚糖酶能够高效降解大麦麦芽糖化醪液中的高分子量阿拉伯木聚糖，从而提高啤酒的生产效率。附图说明图1为木聚糖酶活标准曲线。图2为麦芽内源木聚糖酶抑制剂纯化过程中的SDS-PAGE图谱，泳道1为大麦麦芽水溶性蛋白提取液；泳道2为纯化到电泳纯的大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白；M为标准分子量蛋白。图3为大麦麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的质谱图。图4为添加和未添加BASI的麦芽内切木聚糖酶的Lineweaver-Burk曲线。图5为BASI与麦芽内源木聚糖酶的摩尔比对抑制率的影响。具体实施方式实施例1：麦芽内源木聚糖酶抑制蛋白的纯化具体步骤如下：(1)大麦麦芽中水溶性蛋白的提取细粉碎的大麦麦芽(1kg)悬浮于5L含0.1％(w/v)L-抗坏血酸的pH5.5、0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，4℃提取4h，10000×g离心15min，取上清。(2)SephadexG-25脱盐柱对大麦麦芽水溶性蛋白组分的初步分离采用75％％饱和度的硫酸铵沉淀提取大麦麦芽水溶性蛋白，离心(15min，10000g，4℃)，沉淀溶解于pH8.0、0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，上样(30mL)于经同样缓冲溶液充分平衡的SephadexG-25凝胶柱(1.6cm×80cm)，并用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质在抑制木聚糖酶活力中的应用，其特征在于，所述蛋白NCBI登录号：1210227A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质在抑制木聚糖酶活力中的应用，其特征在于，所述蛋白NCBI登录号：1210227A，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶为大麦麦芽内源木聚糖酶。


3.一种抑制木聚糖酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白以摩尔比2～4:1的比例加入至含木聚糖酶的环境中，于30～40℃反应25～35min。


4.一种筛选对木聚糖酶抑制因子具有抗性的木聚糖酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白质作为抑制剂，加入至含有待筛选的木聚糖酶的反应体系中，于30～40℃反应25～35min，残余酶活相对高的为对权利要求1所述的蛋白质有抗性的木聚糖酶。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包含如下步骤：以终浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖为底物，加入权利要求1所述的蛋白质和待筛选的木聚糖酶溶液在35～40℃下反应28～35mim，测定木聚糖酶的残余活性。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙军勇，陆健，田甜甜，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32