一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用，尤其是一种与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽，以及所述多价多肽在免疫检测中的应用，属于生物技术领域。基于苯噻菌酯噬菌体展示多肽模拟表位的氨基酸序列，以赖氨酸为支架和间隔臂，固相合成获得多价模拟表位多肽；将多价多肽的氮端乙酰化，碳端的赖氨酸侧链提供唯一的游离氨基用于标记。这种多价模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体的亲和力是单价模拟表位多肽的13.6倍，在均相免疫分析方法中可以显著降低检测方法的背景信号，提高检测分析方法的敏感性。该多价模拟表位多肽可作为化学合成半抗原的替代物，建立均相、一步的免疫检测方法，用于快速、灵敏、方便和经济的检测环境和农产品中残留的苯噻菌酯。

A polyvalent benzothiazole ester mimic epitope peptide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用
本专利技术涉及一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽及其应用，尤其是一种与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽，以及所述多价多肽在免疫检测中的应用，属于生物

技术介绍
噬菌体展示多肽技术可快速筛选到与抗体特异性结合的多肽，用于高敏感性免疫分析方法的开发，目前已在农药、毒素等检测对象中得到广泛应用。但噬菌体展示获得的活性多肽片段连接在噬菌体外壳蛋白上，造成整体粒径较大(880×6-7nm)、流动性差、并且存在污染其它生物试剂的风险。此外，噬菌体作为一种非常规试剂，不同批次间差异大、长期储存的稳定性差等问题导致其商业开发价值低。目前研究者已报道出两种有效途径来克服噬菌体的弊端：1)化学合成多肽；2)多肽与其他蛋白进行融合表达。化学合成多肽凭借标记简单、纯度高、可长期储存、易商品化等优点，被视为克服噬菌体颗粒缺陷的有效途径。噬菌体展示多肽技术以是以多拷贝形式将多肽展示在噬菌体外壳蛋白上，如pIII展示为3至5个拷贝，pVIII展示为200个拷贝左右。基于噬菌体展示多肽模拟表位的氨基酸序列，固相合成制备的单价无噬菌体模拟表位多肽的亲和力常常较低，从而无法在免疫分析方法中应用，或建立的免疫分析方法的敏感性较低。因此，多肽模拟表位多肽的研制及应用具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服单价合成多肽模拟表位亲和力低的不足，提供一种与苯噻菌酯单克隆抗体特异性识别的多价模拟表位多肽，及其对环境或农产品中的苯噻菌酯进行免疫检测的用途。本专利技术提供的一种多价苯噻菌酯模拟表位多肽，其特征包括：基于苯噻菌酯噬菌体展示多肽模拟表位的氨基酸序列(CSGLAEFMSC)，以赖氨酸为支架和间隔臂，固相合成获得多价模拟表位多肽；将多价多肽的氮端乙酰化，碳端的赖氨酸侧链提供唯一的游离氨基用于标记(((Ac-CSGLAEFMSC)2K)2KK)。所述的苯噻菌酯多价模拟表位多肽在苯噻菌酯免疫检测中的应用。所述免疫检测方法为酶联免疫吸附分析方法、免疫层析分析方法或基于内滤效应的上转换荧光免疫分析方法。本专利技术具有以下有益效果：(1)新颖：与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽为国内外首次报道；(2)亲和力强：多价模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体的亲和力是单价模拟表位多肽的13.6倍；(3)实用：利用本专利技术提供的多价模拟表位多肽可作为化学合成半抗原的替代物，用于建立免疫分析方法，更加环保；(4)改善分析方法的特性：在均相免疫分析方法中可以显著降低检测方法的背景信号，提高检测分析方法的敏感性。附图说明图1：多价苯噻菌酯模拟表位多肽示意图；图2：质谱检测及分子量比对；图中“A”表示一价苯噻菌酯模拟表位多肽质谱检测结果；“B”表示二价苯噻菌酯模拟表位多肽质谱检测结果；“C”表示四价苯噻菌酯模拟表位多肽质谱检测结果；图中“D”表示一价、二价和四价苯噻菌酯模拟表位多肽质核比(m/z)及质谱和ChemBioDraw软件计算的分子量；图3：等温滴定量热法测试结果；图中“A”表示一价苯噻菌酯模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体亲和力拟合曲线；图中“B”表示二价苯噻菌酯模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体亲和力拟合曲线；图中“C”表示四价苯噻菌酯模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体亲和力拟合曲线；图中“D”表示一价、二价和四价苯噻菌酯模拟表位多肽与苯噻菌酯单克隆抗体亲和力曲线拟合结果及热力学参数；图4：不同价态多肽在相同免疫分析方法中的敏感性比较；图5：不同苯噻菌酯标准品溶液的荧光强度的变化及校正曲线。具体实施方式以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。本专利技术实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。实施例1：多价模拟表位多肽的设计、合成与鉴定基于苯噻菌酯噬菌体展示多肽模拟表位的氨基酸序列(CSGLAEFMSC)，以赖氨酸为支架和间隔臂，形成含有4个拷贝的苯噻菌酯模拟表位多肽；将多价多肽的氮端乙酰化，碳端额外增加一个赖氨酸，其侧链提供唯一的游离氨基用于标记(((Ac-CSGLAEFMSC)2K)2KK)(图1)。按照上述设计方案制备四价苯噻菌酯模拟表位多肽，并用质谱对其分子量进行检测(图2)。通过等温滴定量热法，采用多肽滴定抗体的策略对不同价态模拟表位多肽与抗体之间的亲和力进行评价。其中滴定液体积为150μL，一价、二价和四价多肽溶液的浓度分别为260μM、150μM、50μM，对应样品池中加入体积为400μL浓度分别为6.7μM、10μM和10μM的抗体溶液(硼酸缓冲液代替抗体溶液加入样品池最为阴性对照)。在动态矫正模式下，对热力学参数及亲和力进行分析。测得一价、二价和四价模拟表位多肽与苯噻菌酯当克隆抗体的结合力分别为3.72±0.61×105M-1、6.94±2.51×105M-1、5.06±2.5×106M-1。四价模拟表位多肽相比一价亲和力提高了13.6倍(图3)。实施例2：多价模拟表位多肽在基于内滤效应的免疫分析中的应用上转换发光材料的制备与鉴定：准确称取63.3mgY2O3、276.6mgYb2O3、7.6mgEr2O3和60mL浓硝酸加入到平底烧瓶中，加热至澄清并干燥成粉末，溶解在6mL超纯水中(超声5min)，加入2mL0.7M的柠檬酸钠搅拌10min，逐滴加入1.08g溶解在24mL水中的NaF，将pH调至5.0之后搅拌2小时。放入高压反应釜205℃反应12h。取出后将溶液离心(4000rpm，5min)，沉淀物用水和乙醇各洗涤三次，60摄氏度烘干，室温储存备用。称取40mg上述合成材料重悬于120mL异丙醇中并超声分散30min。转移至35℃培养箱中孵育10min。在快速搅拌条件下加入5mL氨水和40mL超纯水。反应1小时后逐滴加入40mL含50μLTEOS的异丙醇，35℃混合液搅拌反应5h后滴加60mL含400μLAPTES的异丙醇，继续反应1小时。离心后用超纯水和乙醇各洗涤三次，干燥后得到氨基功能化的UCNPs。用透射电子显微镜对上转化发光材料进行了表征，所得纳米颗粒呈规则球形，平均粒径为100nm。经X射线衍射鉴定所得晶型结构为高发光效率六角相。上转化发光材料氨基化前后的傅里叶红外光谱检测结果显示在1089cm-1处的强吸收峰是硅氧键的伸缩振动；3382cm-1和1633cm-1处出现羟基的伸缩振动和氨基的拉伸和弯曲振动吸收峰；CH2基团的不对称和对称拉伸振动分布在2988cm-1和2890cm-1，这些特征吸收峰的变化表明上转换发光材料表层已成功氨基化。上转换发光材料探针的制备与鉴定：称取10mg氨基功能化的上转换发光材料重悬于2.5mL0.01MBB中，超声分散30min。加入50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽，其特征在于，所述多价模拟表位多肽由多个苯噻菌酯模拟表位多肽组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽，其特征在于，所述多价模拟表位多肽由多个苯噻菌酯模拟表位多肽组成。


2.根据权利要求1所述具有与苯噻菌酯单克隆抗体特异性结合的多价模拟表位多肽，其特征在于，以赖氨酸为支架形成多价。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸣华，华修德，陈贺，丁园，杨倩，宗凌烽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32