酪氨酸酶反义寡核苷酸制造技术

提供了靶向人酪氨酸酶mRNA前体的3'剪接位点的肽核酸衍生物。肽核酸衍生物在细胞中有效诱导人酪氨酸酶mRNA的剪接变体，并且可用于在局部施用时安全地治疗涉及人酪氨酸酶蛋白的皮肤病适应症或状况。

Tyrosinase antisense oligonucleotide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酪氨酸酶反义寡核苷酸
本专利技术涉及互补靶向人酪氨酸酶mRNA前体以改善酪氨酸酶介导的皮肤色素沉着的肽核酸衍生物。
技术介绍
黑色素统指在生物体内产生的深色天然和聚合色素。黑色素有三种类型，即，真黑素、褐黑素和神经黑色素。真黑素和褐黑素在皮肤中合成。同时，神经黑色素是在脑中发现的黑色素，其生理功能尚待阐明。皮肤中的黑色素可有效吸收UV(紫外线)，并在自然阳光下保护动物免受UV(紫外线)照射。因此，晒黑是动物可以保护自己免受日光下UV照射的自然过程。在酪氨酸酶存在下，一系列复杂反应后，氨基酸酪氨酸会聚合成真黑素。真黑素是指5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)的聚合物。当酪氨酸在半胱氨酸或谷胱甘肽存在下被酪氨酸酶聚合时，会形成褐黑素。方案1总结了在真黑素和褐黑素生物合成过程中涉及TYR(酪氨酸酶)、TYRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1，即DHICA氧化酶)和TYRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2，即DOPAchrome互变异构酶)的反应。[Int.J.Mol.Sci.vol10,4066-4087(2009)]方案1鉴于酪氨酸酶(TYR)在皮肤黑色素生物合成中起着核心作用，因此TYR抑制剂已被用作或开发为化妆品成分，以减少过度皮肤色素沉着，即色素沉着过度。几篇文章综述了TYR抑制剂对黑素生成的作用。[Int.J.CosmeticSci.vol33,210-221(2011)；Int.J.Mol.Sci.vol10,2440-2475(2009)]氢醌(1,4-二羟基苯)已被用于局部治疗色素沉着过度数十年。[JAMAvol194(9)，965-967(1965)]。已知氢醌通过与酪氨酸酶的活性位点结合来抑制TYR活性。2006年，由于安全隐患(包括潜在致癌性)，美国FDA撤销了所有含氢醌的OTC(非处方药)产品的先前批准。氢醌诱导ROS(活性氧)破坏膜脂和包括酪氨酸酶的蛋白质。膜脂的氧化损伤永久剥夺了黑素细胞。熊果苷(氢醌-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)是从熊果植物中提取的糖基化氢醌。在小麦和梨皮中也发现了熊果苷。像氢醌一样，熊果苷通过竞争性结合TYR的活性位点抑制黑素生成。[J.Pharmacol.Exp.Ther.vol276(2),765-769(1996)]熊果苷对黑素细胞的细胞毒性比氢醌低。脱氧熊果苷是熊果苷的合成衍生物，并且在TYR抑制活性方面与氢醌和熊果苷相当。脱氧熊果苷对黑素细胞的细胞毒性也比熊果苷和氢醌低。[J.Dermatol.Sci.vol55(3),179-184(2009)]。脱氧熊果素可显著改善局部治疗12周的人类受试者的皮肤亮度。[Exp.Dermatol.vol14(8),601-608(2005)]曲酸是在真菌发酵过程中产生的螯合剂，用于生产酱油和清酒，即日本米酒。曲酸已被用于保存或改变食品和化妆品的颜色。曲酸与TYR活性位点的铜离子螯合以抑制黑素生成。它还抑制了DOPAchrome向5,6-二羟基吲哚-2-羧酸的互变异构化。[J.Pharm.Pharmacol.vol46(12),982-985(1994)]。尽管曲酸可以引起接触性皮炎、致敏和红斑，但已广泛用于治疗黄褐斑。[J.DrugsDermatol.vol6(1),32-39(2007)]尽管存在多种TYR抑制剂，但它们在大多数情况下对TYR的IC50值为微摩尔(μM)。[J.EnzymeInhibitionMed.Chem.vol32(1),403-425(2017)]考虑到它们的分子大小，这种IC50值被认为很差，并增加了与其他分子靶交叉反应性的可能性。由于不良的抑制活性转化为大的经皮剂量，因此抑制效力需要显著提高以满足对皮肤色素沉着和安全性的所需的经皮活性。mRNA前体：遗传信息携带在DNA(2-脱氧核糖核酸)上。DNA被转录以在细胞核中产生mRNA前体(前信使核糖核酸)。哺乳动物mRNA前体通常由外显子和内含子组成，并且外显子和内含子相互连接，如下图所示。外显子和内含子的编号如下图所示。mRNA前体结构的示意图mRNA前体的剪接：内含子缺失后，通过一系列复杂反应将mRNA前体加工成mRNA，这些反应统称为“剪接”，如下图总结图示。[Ann.Rev.Biochem.72(1),291-336(2003)；NatureRev.Mol.CellBiol.6(5),386-398(2005)；NatureRev.Mol.CellBiol.15(2),108-121(2014)]通过在mRNA前体与剪接衔接子因子之间形成“剪接体E复合体”(即早期剪接复合体)来启动剪接。在“剪接体E复合体”中，U1结合到外显子N和内含子N的连接处(junction)，而U2AF35结合到内含子N和外显子(N+1)的连接处。因此，外显子/内含子或内含子/外显子的连接处对于早期剪接体复合体的形成至关重要。与U2进一步复合后，“剪接体E复合体”演变为“剪接体A复合体”。“剪接体A复合体”经历一系列复杂反应以缺失或剪接掉内含子以连接相邻外显子。核糖体蛋白质合成：蛋白质由DNA(2-脱氧核糖核酸)编码。响应于细胞刺激或自发地，DNA被转录以在细胞核中产生mRNA前体(前信使核糖核酸)。酶促剪接掉mRNA前体的内含子以产生mRNA(信使核糖核酸)，然后将其转移到细胞质中。在细胞质中，称为核糖体的翻译机制复合体与mRNA结合，并在扫描沿mRNA编码的遗传信息时进行蛋白质合成。[Biochemistryvol41,4503-4510(2002)；CancerRes.vol48,2659-2668(1988)]反义寡核苷酸(ASO)：以序列特异性方式(即互补地)与包括DNA、mRNA和mRNA前体的核酸结合的寡核苷酸称为反义寡核苷酸(ASO)。例如，如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，则ASO可能能够抑制沿mRNA的核糖体蛋白质合成。ASO需存在于细胞质中以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白质合成。剪接的反义抑制：如果ASO与细胞核中的mRNA前体紧密结合，则ASO可能能够抑制或调节mRNA前体剪接为mRNA。ASO需存在于细胞核内以抑制或调节mRNA前体剪接为mRNA。这种对剪接的反义抑制产生了一个或多个缺少ASO靶向外显子的mRNA。这种mRNA被称为“剪接变体”，并且编码的蛋白小于全长mRNA编码的蛋白。原则上，可以通过抑制“剪接体E复合体”的形成来中断剪接。如果ASO紧密结合(5'→3')外显子-内含子的连接处，即“5'剪接位点”，则ASO阻断mRNA前体与因子U1之间的复合体形成，从而阻断“剪接体E复合体”的形成。同样，如果ASO紧密结合(5'→3')内含子-外显子的连接处，即“3'剪接位点”，则不能形成“剪接体E复合体”。在下面提供的附图中示意性地示出了3'剪接位点和5'剪接位点。非天然寡核苷酸：DNA或RNA寡核苷酸易被内源核酸酶降解，从而限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：/n[式I]/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170724 KR 10-2017-0093605;20171207 KR 10-2017-011.一种由式I表示的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
[式I]



其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人酪氨酸酶mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基、氢基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
X和Y独立地表示氘基、氢[H]基、甲酰基[H-C(＝O)-]、氨基羰基[NH2-C(＝O)-]、氨基硫代羰基[NH2-C(＝S)-]、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳基酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基和非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；以及
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自具有与核碱基部分共价连接的取代或未取代的氨基的非天然核碱基。


2.根据权利要求1所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是10至21之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补，或具有来自式I的完整化合物的一个或两个错配而与人酪氨酸酶mRNA前体部分互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn独立地表示氘基或氢基；
X和Y独立地表示氘基、氢基、甲酰基、氨基羰基、氨基硫代羰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、取代或未取代的芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基、取代或未取代的芳基氨基羰基、取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基、取代或未取代的芳氧基硫代羰基、取代基或未取代的烷基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基、取代或未取代的烷基膦酰基、或取代或未取代的芳基膦酰基；
Z表示氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基：



其中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
L1、L2和L3是由式V表示的共价接头，其将碱性氨基共价连接到核碱基部分：



其中，
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基(-CH2-)，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基(-O-)、硫基(-S-)和取代或未取代的氨基[[-N(H)-或-N(取代基)-]；以及
m是1到15之间的整数。


3.根据权利要求2所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至18之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地表示氢基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的烷氧基羰基、或取代或未取代的芳氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是取代或未取代的亚甲基，并且Qm直接连接至碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自取代或未取代的亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到11之间的整数。


4.根据权利要求3所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢基和取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基和氨基；以及
m是1到9之间的整数。


5.根据权利要求4所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自天然核碱基以及非天然核碱基，所述天然核碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少四个独立地选自式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R3和R5是氢基，并且R2、R4和R6独立地代表氢基或取代或未取代的烷基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基；以及
m是1到9之间的整数。


6.根据权利要求5所述的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，
n是11至16之间的整数；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体中的14-聚体mRNA前体序列[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]具有至少10-聚体互补重叠；
式I的化合物与人酪氨酸酶mRNA前体完全互补；
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1和Tn为氢基；
X和Y独立地选自氢基、取代或未取代的烷酰基、或取代或未取代的烷氧基羰基；
Z表示取代或未取代的氨基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和非天然核碱基；
B1、B2、...、Bn-1和Bn中的至少五个独立地选自由式II、式III或式IV表示的非天然核碱基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢基；
Q1和Qm是亚甲基，并且Qm直接连接到碱性氨基基团；
Q2、Q3、...和Qm-1独立地选自亚甲基、氧基；以及
m是...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑多览，朴慧美，韩璿瑛，金昭煐，
申请(专利权)人：奥利通公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR