β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B制造技术

本发明专利技术公开一种β‑呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B

\u03b2 - fructofuranosidase mutants, mutant genes and preparation of vitamin B

【技术实现步骤摘要】
β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及β-呋喃果糖苷酶突变体、突变基因，及其在制备维生素B12中的应用。
技术介绍
维生素B12(VB12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B12参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。由于维生素B12分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。目前，国内外针对维生素B12生产菌生物合成维生素B12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb基因来增加细胞生产维生素B12的能力（程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期）。本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B12。β-呋喃果糖苷酶的作用机理是将蔗糖的葡萄糖基与果糖基的β-(1,4)糖苷键断裂，生成果糖与葡萄糖。果糖与葡萄糖随后进入糖酵解途径。目前，尚未有β-呋喃果糖苷酶cscA用于维生素B12合成的报道。
技术实现思路
本专利技术人对前期筛选出的高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638菌株（CN104342390A），通过对其进行诱变，获得一株产维生素B12能力提高的诱变菌株。本专利技术作了进一步研究以发现对产维生素B12能力有影响的基因。经过研究发现一种发现β-呋喃果糖苷酶基因和其突变基因，其导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B12的能力。本专利技术首先提供一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其多肽氨基酸序列相对于如SEQIDNo.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替换为T，和/或第330位氨基酸替换为L。更具体地，其多肽氨基酸序列如SEQIDNO：5或6所示。进一步地，本专利技术提供上述的β-呋喃果糖苷酶的突变体的编码基因。更具体地，所述核苷酸酸序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。本专利技术尤其提供β-呋喃果糖苷酶编码基因在制备维生素B12中的应用。在具体实施方式中，其是通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。进一步地，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCCNO.9638保藏号的菌株。在某些实施方式中，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因编码具有SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示氨基酸序列的多肽。优选地，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因具有SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示核苷酸序列。经研究证实，本专利技术中，过量表达β-呋喃果糖苷酶基因和突变基因的基因工程菌生物安全（在菌内过表达未对菌体的生长造成影响），尤其可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力。经实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B12的能力达16.7%，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B12的能力即提高20%，尤其是具有两突变位点时提高达25.6%。附图说明图1：质粒载体pBBR-P21-cscA的图谱。图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB12产量。图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。图4：维生素B12的标准曲线图。具体实施方式本专利技术的以下实施例和附图仅说明实现本专利技术的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本专利技术的限制，任何在不脱离本专利技术的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本专利技术的保护范围之内。本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。培养基配方：LB培养基（g/L）：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH4)2SO41，(NH4)2HPO42，MnSO4·H2O0.8，CoCl2·6H2O0.02，MgO0.3，DMBI0.01，ZnSO4·7H2O0.01，CaCO31.5,pH通过NaOH控制在7.0～7.4。发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH4)2SO42，MgSO41.5,K2HPO40.75，CoCl2·6H2O0.14,DMBI0.075，ZnSO4·7H2O0.08，CaCO31，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。检测方法(1)样品预处理取1mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀=0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl2%的NaCN(w/v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。（2）标准品的制备配置梯度维生素B12标准品(20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L)。（3）HPLC检测条件C18-250A柱（Agilent，4.6mmid9×250mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量20µL。（4）维生素B12标准曲线的绘制将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB12浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B12质量浓度C（mg/L）记为横坐标，绘制维生素B12标准曲线。见图4，得回归方程y=19.846x-80.857，R2=0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B12标准曲线计算样品产量。实施例1：常压室温等离子体（ARTP）诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得（1）致死率的测定为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体（ARTP）诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于如SEQ IDNo.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替换为T，或第436位氨基酸替换为T和第330位氨基酸替换为L。/n

【技术特征摘要】
1.一种β-呋喃果糖苷酶的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于如SEQIDNo.4所示氨基酸序列，第436位氨基酸替换为T，或第436位氨基酸替换为T和第330位氨基酸替换为L。


2.如权利要求1所述的β-呋喃果糖苷酶的突变体的编码基因。


3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在，所述编码基因的核苷酸酸序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示。


4.β-呋喃果糖苷酶编码基因在制备维生素B12中的应用，其特征在于，所述β-呋喃果糖苷酶编码基因编码具有SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，董会娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12