盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途，该突变体K321D的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第321位的赖氨酸突变为天冬氨酸获得，其序列如SEQ ID NO.1所示，该盐不为NaCl。与野生酶HJ14GH43相比，本发明专利技术的突变酶K321D在高浓度KCl、Na

Salt tolerant xylosidase mutant k321d and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种木糖苷酶突变体，具体涉及一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途。
技术介绍
木聚糖主要来源于植物细胞壁，约占植物细胞干重的15％～35％，其主链由木糖聚合而成，具有多样的侧链取代基团。内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29:3～23.)。木糖可作为原料，用于生产乙醇、乳酸、木糖醇等。除了木聚糖外，植物的糖蛋白和动物体内的蛋白聚糖中也含有木糖，其皆可被木糖苷酶降解(Leszczuketal.PlantPhysiologyandBiochemistry,2019,139:681～690；Takagakietal.TheJournalofBiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。盐广泛存在于在自然界和各种生产实践中，包括污水、洗涤、制革、食品、造纸等。具有耐盐性的酶可更好地应用于高盐环境生物
，例如，在皮革软化过程中，需要添加硫酸钠，在此过程中加入木聚糖酶，可达到促进皮纤维松散，提高成品革的柔软度、手感和物理机械性能的效果(如中国专利ZL201710574969.3公开的一种基于木聚糖酶作用的动物皮纤维松散方法)。但是，由于高盐浓度下的盐析作用，大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。因此，为了使酶在高盐环境生物
具有更好的应用性，需要提高酶在盐中的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途，该突变体解决了现有酶在高盐浓度下不具有良好的稳定性的问题，具有耐盐性，经高盐浓度处理后仍具有很好的酶活性。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D，该突变体K321D的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第321位的赖氨酸突变为天冬氨酸获得，其序列如SEQIDNO.1所示，该盐不为NaCl。本专利技术还提供了一种编码所述的木糖苷酶突变体K321D的基因k321d，该基因k321d的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种含有所述的基因k321d的重组载体。优选地，所述重组载体采用pEasy-E1。本专利技术还提供了一种含有所述的基因k321d的重组菌。优选地，所述重组菌采用的宿主细胞包含：大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了所述的木糖苷酶突变体K321D在制革、造纸和污水处理中的应用。优选地，所述木糖苷酶突变体K321D用于在含盐液体中对木聚糖或/和含木糖基的物质进行降解，所述盐浓度大于3％，且该盐不为NaCl。优选地，所述盐包含：KCl、Na2SO4和(NH4)2SO4中任意一种或两种以上。本专利技术还提供了一种所述的木糖苷酶突变体K321D的制备方法，其特征在于，该方法包含：将所述的基因k321d与表达载体相连接，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌；培养所述重组菌株，诱导木糖苷酶突变体K321D表达，回收并纯化表达的木糖苷酶突变体K321D。本专利技术的盐耐受的木糖苷酶突变体K321D及其制备方法和用途，解决了现有酶在高盐浓度下不具有良好的稳定性的问题，具有以下优点：与野生酶HJ14GH43相比，本专利技术的突变酶K321D在高浓度KCl、Na2SO4和(NH4)2SO4中的稳定性得到了增强。经20.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性大约剩余30％，而突变酶K321D的活性却从48％升至65％；经10.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性为47～78％，突变酶K321D的活性为93～111％；经20.0～30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，HJ14GH43的活性从79％降至38％，K321D却保持稳定，活性维持在90％以上。因此，本专利技术的在高盐浓度下具有耐受性的木糖苷酶突变体K321D可应用于制革、造纸、污水处理等行业。附图说明图1为野生酶HJ14GH43和突变酶K321D的SDS-PAGE分析。图2为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321D在NaCl中的稳定性。图3为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321D在KCl中的稳定性。图4为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321D在Na2SO4中的稳定性。图5为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321D在(NH4)2SO4中的稳定性。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实验例中使用的实验材料和试剂如下：菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1均购自北京全式金生物技术有限公司；酶类及其它生化试剂：pNP(p-nitrophenol)和pNPX(p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside)均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。以下实验例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照购买的试剂盒和产品说明书进行。实验例1表达载体的构建和转化根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列KY391885(SEQIDNO.4)，合成野生木糖苷酶HJ14GH43的编码基因hJ14GH43；另合成突变酶K321D的编码基因k321d(SEQIDNO.2)；将合成的编码基因hJ14GH43和编码基因k321d的序列分别和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含hJ14GH43和k321d的表达载体，将连接产物分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分别表达野生酶HJ14GH43和突变酶K321D的重组菌株。实施例2野生酶HJ14GH43和突变酶K321D的制备将含hJ14GH43和k321d的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μgmL-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后，将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D，其特征在于，该突变体K321D的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第321位的赖氨酸突变为天冬氨酸获得，其序列如SEQ ID NO.1所示，该盐不为NaCl。/n

【技术特征摘要】
1.一种盐耐受的木糖苷酶突变体K321D，其特征在于，该突变体K321D的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第321位的赖氨酸突变为天冬氨酸获得，其序列如SEQIDNO.1所示，该盐不为NaCl。


2.一种编码如权利要求1所述的木糖苷酶突变体K321D的基因k321d，其特征在于，该基因k321d的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种含有如权利要求2所述的基因k321d的重组载体。


4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pEasy-E1。


5.一种含有如权利要求2所述的基因k321d的重组菌。


6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌采用的宿主细胞包含：大肠杆菌BL21。

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，李娜，韩楠玉，唐湘华，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53