α-L-岩藻糖苷酶及其相关生物材料与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶及其相关生物材料与应用。本发明专利技术公开了一种蛋白质：A1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；A2)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；A3)将A1)或A2)的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；A4)将SEQ ID No.3的蛋白质或SEQ ID No.4的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。本发明专利技术进一步公开了上述蛋白质的相关生物材料及其应用。本发明专利技术提供的蛋白质可高效合成3’‑岩藻糖基乳糖，在寡糖合成中具有良好的应用前景。

\u03b1 - L-Fucosidase and its related biomaterials and Application

【技术实现步骤摘要】
α-L-岩藻糖苷酶及其相关生物材料与应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及α-L-岩藻糖苷酶及其相关生物材料与应用。
技术介绍
岩藻糖基乳糖由一分子岩藻糖和一分子乳糖构成，岩藻糖残基可通过α(1，2)糖苷键连接到乳糖的半乳糖残基上，或通过α(1，3)糖苷键连接到乳糖还原端的葡萄糖。岩藻糖基乳糖大量存在于人乳中，具有调节肠道菌群、抵抗病原菌的粘附、免疫调节及促进大脑发育等多种功能活性(Yvanetal.，HumanMilkOligosaccharides：2’-Fucosyllactose(2’-FL)andLacto-N-Neotetraose(LNnT)inInfantFormula.Nutrients，2018，10：1161.)。目前，化学合成或生物合成的2’-岩藻糖基乳糖已被欧盟和美国FDA批准添加到婴幼儿食品中(Bychetal.，ProductionofHMOsusingmicrobialhosts-fromcellengineeringtolargescaleproduction.CurrentOpinioninBiotechnology，2019，56C：130-137.)，市场对于岩藻糖基乳糖需求日益增加。因此，开发合成岩藻糖基乳糖的方法具有重要意义。酶法合成寡糖具有反应条件温和、可控性良好等优势近年来受到广泛关注(Bojarováetal.，Glycosidasesincarbohydratesynthesis：whenorganicchemistryfallsshort.Chimia(Aarau)，2011，65，65-70.)。糖苷水解酶和糖基转移酶是在寡糖合成中应用较多的两类酶。α-L-岩藻糖苷酶是一类外切糖苷水解酶，能特异性水解岩藻糖基寡糖或岩藻糖基化合物上连接的岩藻糖残基。与岩藻糖基转移酶相比，α-L-岩藻糖苷酶来源广泛、活性高且能使用较为经济的原料作为糖基供体进行寡糖的合成(Lezyk，etal.，Novelα-L-FucosidasesfromaSoilMetagenomeforProductionofFucosylatedHumanMilkOligosaccharides.PLoSONE，2016：1-18.)。目前，α-L-岩藻糖苷酶主要分为4个家族，分别是糖苷水解酶(GH)29、95、141和151家族。根据反应机制，α-L-岩藻糖苷酶可分为保留型和反转型，仅保留型GH29和GH151家族的岩藻糖苷酶具有转糖苷活性(Birgitteetal.SubstratespecificityandtransfucosylationactivityofGH29α-L-fucosidasesforenzymaticproductionofhumanmilkoligosaccharides，NewBiotechnology，2018，41：34-45；Eliseetal.，SYNTHESISOFNEWFUCOSE-CONTA.国际专利：US20140228554A1)。迄今，利用α-L-岩藻糖苷酶的转糖苷活性合成岩藻糖基乳糖的主要限制因素是产物得率低。因此，发掘特性优良、高转糖苷活性的α-L-岩藻糖苷酶具有重要意义。3’-岩藻糖基乳糖尚无天然存在报道，Fuc-α(1，3)-Gal糖苷键存在于一种人乳低聚九糖的末端(Yamashitaetal.，OligosaccharidesofHumanMilk.IsolationandCharacterizationofThreeNewDisialylfucosylHexasaccharides.Arch.Biochem.Biophys.，1976，174：582-591)。有研究通过对乳糖的化学修饰经六步反应获得3’-岩藻糖基乳糖，但制备过程中使用大量有毒试剂、步骤繁芜且产物得率低(Takamura.etal.，ChemicalModificationofLactose.XV.SynthesesofO-α-andO-β-L-Fucopyranosyl-(1→3)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranoses(3′-O-a-and3′-O-β-L-Fucopyranosyllactoses).CarbohydrateResearch，1980：84：53-60)。酶法合成3’-岩藻糖基乳糖的报道很少，仅有Alcaligenessp.来源的α-L-岩藻糖苷酶通过其转糖苷活性合成3’-岩藻糖基乳糖，得率为34％(Murataetal，.Enzymaticsynthesisofalpha-L-fucosyl-N-acetyllac-tosaminesand3′-O-alpha-L-fucosyllactoseutilizingalpha-L-fucosidases.CarbohydrateResearch.1999，320：192-199.)。3’-岩藻糖基乳糖功能活性的报道也很少。研究发现3’-岩藻糖基乳糖可作为抗体探针与腺癌和胚胎癌细胞中相应的抗原发生特异性结合(Miyauchietal.，Anewfucosylantigenexpressedoncolonadenocarcinomaandembryonalcarcinomacells.Nature，1982，299：168-169.)。迄今，尚无3’-岩藻糖基乳糖益生活性的研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为提供一种参与岩藻糖基化合物合成的具有转糖苷活性的蛋白质，以合成或制备3’-岩藻糖基乳糖。为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种蛋白质，来源于地杆菌(Pedobactersp.)，为如下A1)-A4)任一所示：A1)氨基酸序列为SEQIDNo.3的蛋白质；A2)氨基酸序列为SEQIDNo.4的蛋白质；A3)将SEQIDNo.3的蛋白质或SEQIDNo.4的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；A4)将SEQIDNo.3的蛋白质或SEQIDNo.4的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。其中，A1)所示的蛋白质的命名为α-L-岩藻糖苷酶(PbFuc)，SEQIDNo.3由422个氨基酸残基组成。A2)所示的蛋白质的命名为重组α-L-岩藻糖苷酶(PbFuc-His)，其为SEQIDNo.3的PbFuc的N端连接MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEF得到的融合蛋白，SEQIDNo.4由458个氨基酸残基组成。上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下任一所示：/nA1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；/nA2)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；/nA3)将SEQ ID No.3的蛋白质或SEQ ID No.4的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；/nA4)将SEQ ID No.3的蛋白质或SEQ ID No.4的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下任一所示：
A1)氨基酸序列为SEQIDNo.4的蛋白质；
A2)氨基酸序列为SEQIDNo.3的蛋白质；
A3)将SEQIDNo.3的蛋白质或SEQIDNo.4的蛋白质的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
A4)将SEQIDNo.3的蛋白质或SEQIDNo.4的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。


2.权利要求1所述的蛋白质的相关生物材料，其特征在于，所述相关生物材料为如下任一所示：
C1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。


3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于，C1)所述核酸分子为如下任一所示：
B1)编码序列为SEQIDNo.1第10-1278位所示的DNA分子；
B2)编码序列为SEQIDNo.2所示的DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子。

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，史然，马俊文，刘军，闫巧娟，刘海杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11