甘露聚糖酶变体制造技术

本描述涉及甘露聚糖酶的变体、包含所述变体的组合物、其产生方法以及使用所述变体降解和修饰含有甘露聚糖的材料的方法。

Mannanase variants

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甘露聚糖酶变体专利
本专利技术涉及甘露聚糖酶的变体。这些变体在需要降解或修饰甘露聚糖的工业应用中是有用的，例如在洗衣和清洁应用方面，在饲料、食品、纸浆和纸张以及石油工业中。本专利技术还提供了有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物及其生产和使用方法。背景甘露聚糖是在多种植物中发现的含有甘露糖的多糖。甘露聚糖在水环境中溶解性差，其理化性质引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。所有这些特性在若干行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中造成问题。在基于植物的饮食中，存在不同的β-甘露聚糖，根据它们的量和性质，它们会损害营养物质的消化、微生物的定植和生长性能。甘露聚糖的酶降解降低了高水溶性甘露聚糖的消化粘度，并导致甘露寡糖的产生，而甘露寡糖可形成豆科植物中存在的不溶于水的线性甘露聚糖。甘露聚糖酶提高了所有单胃动物的平均日增重、饲料效率、体重均匀度和存活率。对于动物饲料应用(例如含谷类饮食的单胃动物饲料)，甘露聚糖是肠内容物粘度的促进因素，从而它对饲料消化率和动物生长速率有不利影响。对于反刍动物来说，甘露聚糖代表了纤维摄入的主要成分，并且甘露聚糖的较完全消化将有助于较高的饲料转化效率。对于洗衣和清洁应用，包含甘露聚糖酶的酶组合物可用于降解甘露聚糖。然而，提供在变化的储存和使用条件下是稳定的，同时仍然显示出良好的甘露聚糖降解活性的甘露聚糖酶是困难的。蛋白质的N-连接糖基化是一类翻译后修饰，其中称为聚糖的糖分子寡糖连接到蛋白质的天冬酰胺(Asn，N)残基的酰胺氮基团上。这种类型的连接对酶和其它蛋白质的结构和功能都是重要的。本专利技术的一个目的是提供甘露聚糖酶的变体，其在应用于不同的工业过程中时具有改进的稳定性并表现出甘露聚糖酶活性，以及用于甘露聚糖降解或修饰的酶组合物。概述根据第一方面，提供一种具有甘露聚糖酶活性和在283位的非糖基化氨基酸的甘露聚糖酶变体，其中变体选自1)与SEQIDNO:2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；2)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：a)SEQIDNO:1(man7)的核苷酸79-993b)a)的全长互补序列；和3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQIDNO:1或其基因组DNA序列具有至少95%序列同一性；且其中氨基酸编号对应于包含信号序列的SEQIDNO:2(Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。本专利技术的甘露聚糖酶变体在具有良好的稳定性和甘露聚糖酶活性方面是有利的。与野生型甘露聚糖酶相比，该变体具有不同的糖基化模式，当在宿主细胞中产生时，其可提供改进的比活性、稳定性和产率。因此，本专利技术的甘露聚糖酶变体可提供改进的产量和更好的使用性能。该变体在洗涤剂中和在通常用于其中利用甘露聚糖降解的应用(例如在洗衣洗涤剂中)的温度下的稳定性特别好。根据本专利技术的第二方面，提供一种酶组合物，其包含第一方面的甘露聚糖酶变体和a.至少一种防腐剂，例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；b.任选地，至少一种稳定剂，选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；c.任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和d.任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。如实施例所示，根据本专利技术的酶组合物中包含的变体具有允许在重组宿主细胞中产生并使它们可用于工业应用的酶组合物的结构和性质。酶组合物特别适合洗涤剂制剂，因为甘露聚糖酶变体在洗衣和洗涤应用中用来降解甘露聚糖时具有良好的稳定性、洗涤性能和比活性。根据第三方面，提供一种包含第一方面的甘露聚糖酶变体或第二方面的酶组合物的洗涤剂组合物。本专利技术的洗涤剂组合物的优点在于，它在去除含甘露聚糖的污点方面是有效且经济的。根据另一个方面，提供本专利技术的酶组合物或本专利技术的甘露聚糖酶变体在洗涤剂中的用途和使用方法。根据第四方面，提供一种包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许生产至少一种包含第一方面的甘露聚糖酶变体的重组多肽。根据第五方面，提供一种生产具有甘露聚糖酶活性的重组多肽的方法，该方法包括：a.培养第四方面的重组宿主细胞，其中遗传元件包含至少一个控制序列，其控制重组宿主细胞中重组多肽的产生；遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，用于将重组多肽运出宿主细胞；和培养是在允许生产重组多肽的条件下进行的；和b.回收重组多肽。该方法提供一种生产包含甘露聚糖酶变体的重组多肽的有效方法。由于甘露聚糖酶变体是在重组宿主细胞中产生的，因此提供了一种生产系统，该系统可以以期望的方式进行优化、定制和控制。由该方法生产的甘露聚糖酶变体可能与天然甘露聚糖酶在结构和功能水平上不同。由该方法生产的甘露聚糖酶变体具有糖基化模式，或其他翻译后修饰，与天然甘露聚糖酶(例如具有类似氨基酸序列的甘露聚糖酶)相比，或与具有相同氨基酸序列但在另一宿主细胞中生产的甘露聚糖酶相比，其导致结构和/或功能的差异。特别地，当变体在能够N-连接糖基化的宿主细胞中产生时，变体有利地具有非糖基化残基Asn283，从而改进了性质。由本专利技术方法生产的甘露聚糖酶变体可原样使用或配制成选定的制剂。根据另一个方面，提供一种包含具有甘露聚糖酶活性并可通过使用本专利技术的宿主细胞获得的重组多肽的酶制剂。酶制剂或酶组合物还可包含选自以下的其它酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，以及选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、促净剂、抗再沉积剂、光学增白剂、染料、颜料、香料、腐蚀剂、磨料和防腐剂的合适的添加剂。根据第六方面，提供一种降解或修饰含甘露聚糖的材料的方法，其包括用有效量的本专利技术的酶组合物或本专利技术的甘露聚糖酶变体处理所述含甘露聚糖的材料。根据第七方面，提供一种动物饲料，其包含本专利技术的酶组合物或本专利技术的甘露聚糖酶变体，和至少一种植物来源的蛋白来源或含甘露聚糖的产物或副产物，和a.任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚醣酶、β-葡聚糖酶或其组合；和b.任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有甘露聚糖酶活性和在283位的非糖基化氨基酸的甘露聚糖酶变体，其中所述变体选自/n1) 与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；/n2) 由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：/na) SEQ ID NO: 1 (

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170530 EP 17173411.41.一种具有甘露聚糖酶活性和在283位的非糖基化氨基酸的甘露聚糖酶变体，其中所述变体选自
1)与SEQIDNO:2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下核苷酸杂交：
a)SEQIDNO:1(man7)的核苷酸79-993
b)a)的全长互补序列；和
3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQIDNO:1或其基因组DNA序列具有至少95%序列同一性；
并且其中所述氨基酸编号对应于包含信号序列的SEQIDNO:2(Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。


2.权利要求1的变体，其中至少N283、T285或S285位，优选T285或S285位，最优选T285位，被当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中表达时阻止残基283的N-连接的糖基化的残基替换。


3.权利要求1或2的任一项的变体，其中T285或S285位被替换为T或S以外的残基。


4.一种酶组合物，其包含权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体和
a.至少一种防腐剂，例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐例如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b.任选地，至少一种稳定剂，选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c.任选地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d.任选地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。


5.权利要求4的酶组合物，其呈液体组合物或固体组合物的形式，例如溶液、分散体、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、结晶、晶浆、凝胶或小球。


6.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1-3的任一项的甘露聚糖酶变体或权利要求4-5的酶组合物。


7.权利要求6的洗涤剂组合物，其呈液体洗涤剂或固体洗涤剂的形式，优选呈条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的袋、普通或致密粉末、微粒、颗粒、糊剂、凝胶或普通、致密或浓缩液体的形式。


8.权利要求6或7的洗涤剂组合物，其还包含选自以下的一种或多种另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。


9.一种包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许至少产生包含权利要求1-3的甘露聚糖酶变体的重组多肽。


10.权利要求9的重组宿主细胞，其中宿主细胞选自：
真菌细胞，
来自子囊菌门(DivisionAscomycota)，盘菌亚门(SubdivisionPezizomycotina)的丝状真菌细胞；优选来自粪壳菌纲(ClassSordariomycetes)，肉座菌亚纲(SubclassHypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；
更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma)(无性型肉座菌属(anamorphofHypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；
更优选来自里氏木霉(Trichodermareesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecori...

【专利技术属性】
技术研发人员：T莱诺宁，L瓦尔塔卡利，M泽福里德，K容图宁，T普拉宁，
申请(专利权)人：生化酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI