低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途制造技术

本发明专利技术公开了一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的木糖苷酶突变体MutLK10与野生酶HJ14GH43相比，其热适应性质发生了变化，MutLK10在20℃具有更高的酶活，更容易热变性，使得易于通过温度变化控制酶催化反应，能够应用于食品、酿酒、水产等行业。

Mutlk10, a low temperature modified xylosidase mutant, and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途
本专利技术涉及一种木糖苷酶突变体，具体涉及一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途。
技术介绍
木聚糖主要来源于植物细胞壁，约占植物细胞干重的15％～35％，其主链由木糖聚合而成，具有多样的侧链取代基团，完全水解木聚糖需要多种酶的协同作用，包括内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)等。内切木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶可将低聚木糖水解为木糖(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29:3～23.)。木糖可作为原料，用于生产乙醇、乳酸、木糖醇等。除了木聚糖外，植物的糖蛋白和动物体内的蛋白聚糖中也含有木糖，其皆可被木糖苷酶降解(Leszczuketal.PlantPhysiologyandBiochemistry,2019,139:681～690；Takagakietal.TheJournalofBiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。低温酶可应用于低温环境要求下的生物
，如：清酒和葡萄酒的发酵温度一般<25℃，水产生境常常为10～25℃。低温下的处理(如：果汁澄清)可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，将中温或者高温处理方式转为低温处理方式还可起到降低能耗的作用(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449～460.)。低温活性越高的酶往往对热越敏感，即越容易热变性，热变性又使酶容易被降解，该特性使酶的催化反应得以简易控制，同时使酶的使用更具安全性，在低温生物技术特别是食品领域具有应用的价值。因此，低温适应性更优的酶具有重要的开发价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，该突变体MutLK10能够适应低温，且在温度提高后活性降低，易于控制酶催化反应。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种编码所述的木糖苷酶突变体MutLK10的基因mutlk10，该基因mutlk10的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种含有所述的基因mutlk10的重组载体。优选地，所述重组载体采用pEasy-E1。本专利技术还提供了一种含有所述的基因mutlk10的重组菌。优选地，所述重组菌采用的宿主细胞包含：大肠杆菌BL21。本专利技术还提供了所述的木糖苷酶突变体MutLK10在食品、酿酒、水产行业中的应用。优选地，所述木糖苷酶突变体MutLK10用于在低温中对木聚糖或/和含木糖基的物质进行降解，所述低温为10～25℃。优选地，通过调高温度控制木糖苷酶突变体MutLK10对木聚糖或/和含木糖基的物质的降解。本专利技术还提供了一种所述的木糖苷酶突变体MutLK10的制备方法，该方法包含：将所述的基因mutlk10与表达载体相连接，获得重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌；培养所述重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutLK10表达，回收并纯化表达的木糖苷酶突变体MutLK10。本专利技术的低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10及制备和用途，具有以下优点：与野生酶HJ14GH43相比，突变酶MutLK10的热适应性质发生了变化，MutLK10在20℃具有更高的酶活，更容易热变性，使得易于通过温度变化控制酶催化反应。野生酶HJ14GH43的最适温度为25℃，突变酶MutLK10的最适温度为20℃；野生酶HJ14GH43分别在10℃和20℃时处理60min，酶活分别剩余88％和70％，而突变酶MutLK10在10℃时处理60min，酶活剩余69％，MutLK10在20℃时半衰期约为20min。本专利技术的低温适应性改良的木糖苷酶突变体MutLK10可应用于食品、酿酒、水产等行业。附图说明图1为野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的SDS-PAGE分析结果。图2为纯化的突变酶MutLK10的pH活性结果。图3为纯化的突变酶MutLK10的pH稳定性结果。图4为纯化的突变酶MutLK10的热活性结果。图5为纯化的突变酶MutLK10的热稳定性结果。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实验例中的实验材料和试剂如下：菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1均购自北京全式金生物技术有限公司；酶类及其它生化试剂：pNP(p-nitrophenol)和pNPX(p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside)均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。以下实验例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实验例1表达载体的构建和转化根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列KY391885(SEQIDNO.4)，合成野生木糖苷酶HJ14GH43的编码基因hJ14GH43；另合成突变酶MutLK10的编码基因mutlk10(SEQIDNO.2)。将合成的木糖苷酶核苷酸和突变酶MutLK10核苷酸序列分别和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含hJ14GH43和mutlk10的表达载体；将连接产物分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分别表达野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的重组菌株。实验例2野生酶HJ14GH43和突变酶MutLK10的制备将含hJ14GH43和mutlk10的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μgmL-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后，将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μgmL-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10，其特征在于，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种低温改良的木糖苷酶突变体MutLK10，其特征在于，该突变体MutLK10的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第317～329位的氨基酸序列KIEEKVFAPTYHT突变为SVEEVSWEKDYDE获得，其序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码如权利要求1所述的木糖苷酶突变体MutLK10的基因mutlk10，其特征在于，该基因mutlk10的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种含有如权利要求2所述的基因mutlk10的重组载体。


4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用pEasy-E1。


5.一种含有如权利要求2所述的基因mutlk10的重组菌。


6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌采用的宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，曹丽娟，李娜，韩楠玉，唐湘华，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53