一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法。包括下述步骤：(1)选择溶菌酶；(2)配制诱导缓冲液；(3)一定浓度溶菌酶溶液配制；(4)不同温度诱导。本专利将高活性的溶菌酶溶解在甘氨酸‑盐酸缓冲体系中，人为的创造强酸性条件，有利于溶菌酶蛋白二级结构的转化；本专利高温诱导时有利于蛋白质错误折叠形成淀粉样纤维聚集体，有利于更好的建立淀粉样纤维化模型，并且可以提高溶菌酶淀粉样纤维化的成功率，得到的纤维韧性更强。能减少因为环境问题导致的实验误差，并且不存在批次差异的诱导方法，提高了利用此模型获得数据的重复性、稳定性，方法简单，利于推广。

A method of inducing lysozyme amyloid fiber model

【技术实现步骤摘要】
一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法
本专利技术涉及模拟疾病模型构建领域，尤其涉及一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer'sdisease，AD)、帕金森综合征(Parkinson'sdisease，PD)等神经退行性疾病的主要病理学过程为相关蛋白质发生错误折叠形成淀粉样纤维，淀粉样纤维聚集在中枢神经系统，导致神经元细胞损伤，信号传导发生改变，甚至神经元丧失等。研究神经退行性疾病的机理、蛋白质淀粉样纤维的形成条件以及形成过程尤为重要。然而由于研究淀粉样纤维形成所使用的蛋白质材料成本较高，且淀粉样纤维形成过程与形成条件不确定，为科学研究带来了巨大的经济风险，因此需要选择一种结构明确、易获得、低成本的蛋白质材料作为替换品，用来研究蛋白错误折叠过程并确定淀粉样纤维体外聚集的条件，为神经退行性疾病的病理学机理研究提供参考。蛋清溶菌酶价格相对较低，易获取，结构明确，是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链，有4对二硫键维持构型，各参数研究明确，能提供作为体外研究淀粉样纤维形成替代蛋白所需要的条件。但蛋清溶菌酶属于正常蛋白，形成的淀粉样纤维在体内不具有毒性，成为体内评价过程中的不足与缺陷。
技术实现思路
专利技术的目的：为了提供一种效果更好的溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。为了达到如上目的，本专利技术采取如下技术方案：一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，其特征在于包括下述步骤：(1)选择溶菌酶：选用蛋清溶菌酶作为淀粉样纤维化模型的材料；(2)配制诱导缓冲液：称取一定量甘氨酸固体颗粒，用水溶解，用HCl调节pH2.0，配制成为甘氨酸-盐酸母液，备用；(3)一定浓度溶菌酶溶液配制：称取0.0143g蛋清溶菌酶粉末，按照质体比为0.0143g:1mL50mM甘氨酸—盐酸缓冲液完全溶解；(4)不同温度诱导：在不同温度条件下振荡诱导8h，转至低温条件静置诱导6d。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(1)中，所述蛋清溶菌酶来源于直接购买或自制。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(2)中，所述甘氨酸固体颗粒为MP生物公司的分子级试剂或者分析级甘氨酸固体颗粒，配制后过滤，滤膜孔径为0.22～0.45μm；浓度为40～60mM。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(2)中，所述水为超纯水或无菌水，自制或者购买均可；盐酸使用浓盐酸或稀盐酸均可，调节pH为1.8～12.0。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(3)中，所述一定浓度蛋清溶菌酶为20～200μM。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(4)中，所述高温条件为55℃～68℃，诱导时间为0.5h～24h，振荡速度为180～300rpm。本专利技术进一步技术方案在于：步骤(4)中，所述低温条件为2℃～6℃，诱导时间为6～11d。采用如上技术方案的本专利技术，相对于现有技术有如下有益效果：(1)本专利技术能充分利用低价的溶菌酶蛋白来替代高价蛋白来作为诱导模型，在保证淀粉样纤维韧性与可操作性的同时，大幅度的节省费用。(2)高温诱导与低温诱导结合的方法，节省电力的同时，延长样品的操作时间，降低降解率。(3)本专利技术科学合理,大幅延长实验操作性，提高经济效益，容易推广。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐明本专利技术，应理解下述具体实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，包括下述步骤：(1)选择溶菌酶：选用蛋清溶菌酶作为淀粉样纤维化模型的材料；(2)配制诱导缓冲液：称取一定量甘氨酸固体颗粒，用水溶解，用HCl调节pH，配制成为甘氨酸-盐酸母液，备用；(3)一定浓度溶菌酶溶液配制：称取一定量的蛋清溶菌酶粉末，按照比例溶解；(4)不同温度诱导：在高温条件下振荡诱导一定时间后，转至低温条件静置诱导一定时间；步骤(1)中，所述蛋清溶菌酶来源于直接购买，但不局限于购买，也可使用实验室纯化蛋清溶菌酶。步骤(2)中，所述甘氨酸为分子级试剂，但不局限于此，可使用分析级甘氨酸，配制后过滤，滤膜孔径为0.22～0.45μm；一定浓度为40～60mM。步骤(2)中，所述水为超纯水或无菌水，自制或者购买均可；盐酸使用浓盐酸和稀盐酸均可，调节pH为1.8～12。步骤(3)中，所述一定浓度蛋清溶菌酶为20～200μM。步骤(4)中，所述高温条件为55～68℃，诱导时间为0.5～24h，振荡速度为180～300rpm。高温条件可选用不同温度。步骤(4)中，所述低温条件为2～6℃，诱导时间为6～20d。更具体的实施方式如下：实施例：(1)选择溶菌酶：选用MCE生物公司购买的蛋清溶菌酶粉末。(2)选择诱导缓冲液：选用MP生物公司的分子级甘氨酸，称取0.375g，40mL左右自制超纯水完全溶解，稀盐酸调节pH至2.0，定容至100mL，配置成为50mM缓冲液，待用。(3)一定浓度溶菌酶溶液配制：称取购买自MCE公司的蛋清溶菌酶粉末0.0143g，使用10mL甘氨酸—盐酸缓冲液完全溶解，配置成为100μM的样品。(4)不同温度诱导：在65℃250rpm条件下诱导8h，转移至4℃冰箱中诱导8天，透射电子显微镜下观察得到淀粉样纤维，表明诱导成功。以上显示和描述了本专利技术的基本原理和主要特征及本专利技术的优点。本行业的技术人员应该了解上述实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的诱导方法，都包含在本专利技术的保护范围之内。经本实验室多次不同条件实验重复，证明本专利技术条件实验重复性极高，在同样保存条件下，本专利技术条件得到的样品保存时间明显优于其他条件(约20-50％)，延长了保存时间。报道文献诱导时间较长，平均为15d，本专利技术在10d内能够完成整个实验过程，且利用实验室普遍保存条件4℃，避免重复使用摇床或水浴，节省时间的同时也节约了电力成本。与已报道文献比较，本专利技术得到的纤维韧性显著增高。总的来说：本专利技术公开了一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法。一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，包括下述步骤：(1)选择溶菌酶；(2)配制诱导缓冲液；(3)一定浓度溶菌酶溶液配制；(4)不同温度诱导。本专利技术的溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法：(1)将高活性的溶菌酶溶解在甘氨酸-盐酸缓冲体系中，人为的创造强酸性条件，有利于溶菌酶蛋白二级结构的转化；(2)高温诱导时有利于蛋白质错误折叠形成淀粉样纤维聚集体，有利于更好的建立淀粉样纤维化模型，并且可以提高溶菌酶淀粉样纤维化的成功率，得到的纤维韧性更强。本专利技术提供了一种既能提高溶菌酶淀粉样纤维制备的方法，又能减少了因为环境问题导致的实验误差，并且不存在批次差异的诱导方法，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，其特征在于包括下述步骤：/n(1)选择溶菌酶：选用蛋清溶菌酶作为淀粉样纤维化模型的材料；/n(2)配制诱导缓冲液：称取一定量甘氨酸固体颗粒，用水溶解，用HCl调节pH2.0，配制成为甘氨酸-盐酸母液，备用；/n(3)一定浓度溶菌酶溶液配制：称取0.0143g蛋清溶菌酶粉末，按照质体比为0.0143g:1mL 50mM甘氨酸—盐酸缓冲液完全溶解；/n(4)不同温度诱导：在不同温度条件下振荡诱导8h，转至低温条件静置诱导6d。/n

【技术特征摘要】
1.一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)选择溶菌酶：选用蛋清溶菌酶作为淀粉样纤维化模型的材料；
(2)配制诱导缓冲液：称取一定量甘氨酸固体颗粒，用水溶解，用HCl调节pH2.0，配制成为甘氨酸-盐酸母液，备用；
(3)一定浓度溶菌酶溶液配制：称取0.0143g蛋清溶菌酶粉末，按照质体比为0.0143g:1mL50mM甘氨酸—盐酸缓冲液完全溶解；
(4)不同温度诱导：在不同温度条件下振荡诱导8h，转至低温条件静置诱导6d。


2.如权利要求1所述一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，其特征在于：步骤(1)中，所述蛋清溶菌酶来源于直接购买或自制。


3.如权利要求1所述一种溶菌酶淀粉样纤维模型的诱导方法，其特征在于：步骤(2)中，所述甘氨酸固体颗粒为MP生物公司的分子级试剂或者分析级甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：白瑜，李颖，
申请(专利权)人：陕西理工大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61