脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法技术

本发明专利技术涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，属于生物医学技术领域，所述方法包括预诱导分化步骤，所述预诱导分化步骤包括以下操作，将间充质干细胞按1～5×10

Differentiation of cord mesenchymal stem cells into dopaminergic neurons

【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是常见于老年人的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔兹海默病，位于第二位，一直是临床治疗的难点。目前认为其主要是因为脑中多巴胺能神经元的退行性变，大脑的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的药物和手术疗法能缓解疾病的早期临床症状，但无法阻止或逆转多巴胺能神经元退行性变，而且长期使用有明显的副作用。且随着我国人口平均寿命延长和社会老龄化进程加速，帕金森病的发病率呈明显上升趋势，已成为一个严重的社会问题，帕金森病主要的病理生化改变是位于中脑黑质致密区的多巴胺能神经元渐进性变性坏死，致使黑质-纹状体通路多巴胺神经递质水平下降，引起锥体外系的功能失调，从而导致以随意运动减慢、肌张力僵直、肢体震颤和正常的姿势平衡反射丧失为主的临床症状。长期以来，人们一直在寻找能够有效治疗帕金森病的方法，由于本病主要是源于多巴胺能神经元变性死亡而致，若能将合成和分泌多巴胺的细胞移植入黑质-纹状体系统，理论上讲是最为理想的治疗措施，可以起到治愈该病的作用。但这种疗法却存在难以克服的困难，主要限制因素是无法同时获得足够用于移植的胚胎组织，所以，寻找新的细胞来源已成为细胞替代治疗首要解决的问题。自2000年的Erices等报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物。目前，人们已经可以成功的体外分离培养脐带血间充质干细胞，且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。脐带间充质干细胞(MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现，MSC在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。目前体外诱导的方法主要分为3种：①神经营养因子和细胞因子，如维甲酸、脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等诱导分化。②化学试剂，如二甲基亚砜、2-巯基乙醇、丁羟茴醚等诱导分化。③基因转染或修饰的诱导分化。全骨髓培养得到的MSCs在体外合适条件和诱导因子作用12天可分化为表达多巴胺神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的神经元样细胞，并具有一定的电生理活性，分化效率可达67％，是目前骨髓间充质干细胞能达到的最大分化率以及最短的诱导时间。然而，目前技术难以通过体外诱导分化得到足够数量的单一且成熟的多巴胺能神经元，而且移植后的细胞存活数量有限、移植细胞不易与原有神经网络融合都在一定程度上限制了其临床应用。因此，在细胞替代治疗帕金森病，提高骨髓间充质干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的分化效率是解决这些问题的关键。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，该脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法可将脐带间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元，且分化效率高，诱导时间短，同时操作简单、方便。本专利技术的采用的技术方案是，一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，该方法包括预诱导分化步骤，所述预诱导分化步骤包括以下操作：将间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待间充质干细胞贴壁后，于低氧环境下用含黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天；其中，黄酮类诱导物在诱导液中的浓度为8-12ng/ml。本专利技术的方法中，对间充质干细胞先进行预诱导分化，且在预诱导过程中于低氧环境下采用黄酮类诱导物对间充质干细胞进行诱导，黄酮类诱导物可与间充质干细胞表面的受体相结合，从而使间充质干细胞向多巴胺能神经元方向分化。具体的，黄酮类诱导物可激活间充质干细胞内与神经细胞定向分化相关的信号通路Wnt/β-cantine、BMPs/Smad和Nother等，从而促进间充质干细胞向神经细胞分化；另外，黄酮类诱导物还可能促进间充质干细胞上与神经生长、分化有关的细胞因子表达，如NGF、NT-3和BDNF等细胞因子，这些因子能诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化。同时，低氧环境对间充质干细胞向多巴胺能神经元分化也起着关键性作用，因为在分化过程中间充质干细胞还受外部环境影响和调控，低氧环境有利于间充质干细胞向多巴胺能神经元分化，且低氧环境与黄酮类诱导物可产生协同作用，有效提高了间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的效率和选择性。作为对上述技术方案的进一步限定，该方法还包括于所述预诱导分化步骤后进行的诱导分化步骤。作为对上述技术方案的进一步限定，所述诱导分化步骤包括以下操作：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有胶质细胞源性神经营养因子和音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天。于预诱导分化步骤后继续进行诱导分化步骤，以使经预诱导分化后形成的神经细胞样形态的细胞经胶质细胞源性神经营养因子和因素波状蛋白进一步诱导从而继续向多巴胺能神经元分化，从而提高分化率及选择性，且也可缩短诱导分化时间。其中，所述胶质细胞源性神经营养因子在间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的进程中可促进RET的表达，而RET通过与间充质干细胞膜表面的GDNFα1受体结合而引起RET二聚化及酪氨酸残基位点发生自体磷酸化，而后进一步激活MARK、P13K、PLCγ等信号途径，从而激活信息在胞内传到，引起神经细胞表型的转化。所述音速波状蛋白是一种重要的发育调控因子，其在中脑多巴胺能神经元发生、发育和分化过程中起到重要的作用，能够调控着神经轴和背腹轴多巴胺能神经元的发育，同时能序贯激活一系列转录因子，包括Otx2、Lmx1a/b、En1/2、Msx1/2、Ngn2、Mash1。另外，胶质细胞源性神经营养因子还具有促进多种神经元存活与分化的功能，是一种重要的神经保护因子，其可以激活一系列胞内反应，上调抗凋亡基因Bcl-xL的表达，如此可有效降低分化为多巴胺能神经元的凋亡水平，使分化成的多巴胺能神经元具有较高的存活率，且细胞状态好。作为对上述技术方案的进一步限定，所述胶质细胞源性神经营养因子的浓度为30-70ng/ml，所述音速波状蛋白的浓度为5-15ng/ml。作为对上述技术方案的进一步限定，所述低氧环境中的氧浓度为3％-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于，该方法包括预诱导分化步骤，所述预诱导分化步骤包括以下操作：/n将间充质干细胞按1～5×10

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于，该方法包括预诱导分化步骤，所述预诱导分化步骤包括以下操作：
将间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待间充质干细胞贴壁后，于低氧环境下用含黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天；
其中，黄酮类诱导物在诱导液中的浓度为8-12ng/ml。


2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于：该方法还包括于所述预诱导分化步骤后进行的诱导分化步骤。


3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于，所述诱导分化步骤包括以下操作：
将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有胶质细胞源性神经营养因子和音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天。


4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，其特征在于：所述胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的浓度为30-70ng/ml，所述音速波状蛋白的浓度为5-15ng/ml。


5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：安胜军，张君，赵莹茜，
申请(专利权)人：安胜军，
类型：发明
国别省市：河北;13