一种将小鼠成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元的方法技术

本发明专利技术涉及一种多巴胺神经元及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：用MEFs培养基培养小鼠成纤维细胞12h后，加入Ascl1、Lmx1a、Nurr1三个转录因子进行感染，感染12‑20h后，换为含有多西环素的MEFs培养基进行培养；再用含有多种小分子的神经元诱导培养基继续诱导培养，换为神经元维持培养基，即可得到所述多巴胺能神经元。本发明专利技术所述的多巴胺神经元制备方法，可以直接将小鼠成纤维细胞诱导转分化为多巴胺能神经元，不需要先将成纤维细胞重编程为多能干细胞，再分化为多巴胺能神经元，技术简化，操作方便，而且转分化效率可达15％左右。由本发明专利技术所述制备方法获得的神经元树突更多，更长，神经元质量更优。

A method of transforming mouse fibroblasts into dopaminergic neurons

【技术实现步骤摘要】
一种将小鼠成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元的方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及小鼠成纤维细胞向多巴胺神经元转分化的方法。
技术介绍
神经退行性疾病是由于特定部位的神经元细胞丧失导致的神经疾病。如帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病，其主要是环境、遗传以及生理等复杂因素导致黑质致密部多巴胺能神经元(DA)死亡退化，在临床上表现为震颤，肌强直，步态异常，运动迟缓等，对人类的健康构成了巨大的威胁。在临床上，人们试图通过电刺激或者化学药物治疗这类疾病，但效果差强人意。因此到目前为止，仍没有很好的治疗策略。近年来利用某些具有特定功能的细胞替代受损组织细胞的细胞治疗手段，为这些疾病的治疗带来了曙光。因此如能在体外获取多巴胺能神经元，移植到帕金森患者大脑中，可以取代已经死亡的神经元，减轻疾病症状，并有望达到治疗效果，因此，获得多巴胺能神经元在再生医学和基础研究领域都具有重要意义。目前胚胎干细胞(ESCs)定向神经元分化是获取功能性神经元和治疗神经性疾病的重要途径，但由于免疫排斥和伦理等因素极大限制了该策略的应用。当前在临床应用上，神经元移植面临来源短缺、移植后免疫排斥等问题。尽管随着体细胞重编程技术的出现，将来自病人的成体细胞通过重编程技术获得诱导多能干细胞(iPSCs)，然后再将iPSCs分化为有功能的神经干细胞及神经元；但由于需要体细胞重编程和多能干细胞的神经分化两个步骤，该过程时间长、效率低；需花费大量时间和人力物力。
技术实现思路
为了解决当前多巴胺能神经元的体外获取问题，本专利技术的目的之一提供了一种由小鼠成纤维细胞诱导转分化为多巴胺能神经元的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种制备多巴胺能神经元的方法，包括以下步骤：(1)种植小鼠成纤维细胞到用基质胶(Matrigel)包被的培养板上；用MEFs培养基培养12h后，加入Ascl1、Lmx1a、Nurr1三个转录因子进行感染，感染12-20h后，换为含有多西环素(dox)的MEFs培养基进行培养；(2)培养3天后，换为神经元诱导培养基，培养基中包括有：成纤维细胞生长因子(bFGF)，转化生长因子β3(TGFb3),BMP抑制剂dorsomorphin，糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR9901，Shh信号通路激活剂Purmorphamine，TGFβ通路抑制剂SB431542,维生素C(vitaminC)，ROCK抑制剂Y-27632并记为第0天，诱导培养；(3)诱导培养6天后，撤去所述dorsomorphin、所述CHIR99021、和所述SB431542；加入促进神经元成熟因子BDNF，脑源性神经营养因子GDNF；培养到第12天后，撤去多西环素(dox)，换为神经元维持培养基，继续培养12-16，即可得到所述多巴胺能神经元。本专利技术的另一目的是提供上述制备方法得到的多巴胺能神经元。本专利技术所述制备多巴胺能神经元的方法，结合转录因子Ascl1、Lmx1a、Nurr1以及小分子化合物6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶(dorsomorphin)、6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲(CHIR99021)、9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺(Purmorphamine)、4-[4-(1,3-苯并二恶英-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)、维生素C、(R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(Y-27632dihydrochloride)可以直接将小鼠成纤维细胞诱导转分化为多巴胺能神经元，不需要先将成纤维细胞重编程为多能干细胞，再分化为多巴胺能神经元，技术简化，操作方便，节省时间和人力成本，而且转分化效率可达15％左右。由本专利技术所述制备方法获得的神经元树突更多，更长，神经元质量更优。附图说明图1pHAGE2-TetOminiCMV-Ascl1、Flag/Lmx1a、6xHis/Nurr1-HA四环素诱导慢病毒表达载体图谱。图2Ascl1、Lmx1a、Nurr1基因PCR扩增电泳胶图。图3小鼠成纤维细胞诱导转分化过程示意图。图4小鼠成纤维细胞诱导转分化过程中细胞形态图。图5免疫染色检测小鼠成纤维细胞转分化后多巴胺神经元标记基因的表达情况。图6实施例2所示方法的转分化效率统计。具体实施方式除非另外指明，本专利技术的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。定义：多西环素，以下简称DOX(doxycycline),中文别名：强力霉素.。转分化(transformation)已经分化细胞的在一定条件下失去其原有的形态与功能特征，转变成为其他类型的细胞，称为转分化。现在将公开制备多巴胺能神经元的示例性的非限制性实施方案：一种制备多巴胺能神经元的方法，包括以下步骤：(1)种植小鼠成纤维细胞到用基质胶(Matrigel)包被的培养板上；用MEFs培养基培养12h后，加入Ascl1、Lmx1a、Nurr1三个转录因子进行感染，感染12-20h后，换为含有多西环素(dox)的MEFs培养基进行培养；(2)培养3天后，换为神经元诱导培养基，培养基中包括有：成纤维细胞生长因子(bFGF)，转化生长因子β3(TGFb3),BMP抑制剂dorsomorphin，糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR9901，Shh信号通路激活剂Purmorphamine，TGFβ通路抑制剂SB431542,维生素C(vitaminC)，ROCK抑制剂Y-27632并记为第0天，诱导培养；(3)诱导培养6天后，撤去所述dorsomorphin、所述CHIR99021、和所述SB431542；加入促进神经元成熟因子BDNF，脑源性神经营养因子GDNF；培养到第12天后，撤去多西环素(dox)，换为神经元维持培养基，即可得到所述多巴胺能神经元。在一个实施方案中，所述转录因子Ascl1、Lmx1a、Nurr1的用量比优选为：(0.8-1.2)：(0.8-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备多巴胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)用MEFs培养基培养小鼠成纤维细胞12h后，加入Ascl1、Lmx1a、Nurr1三种转录因子进行感染，感染12-20h后，换为含有多西环素的MEFs培养基进行培养；/n(2)培养3天后，换为神经元诱导培养基，所述神经元诱导培养基中包括有：成纤维细胞生长因子，转化生长因子β3，BMP抑制剂dorsomorphin，糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR9901，Shh信号通路激活剂Purmorphamine，TGFβ通路抑制剂SB431542，维生素C，ROCK抑制剂Y-27632，换培养基的当天记为第0天，诱导培养；/n(3)诱导培养6天后，撤去所述神经元诱导培养基中所述dorsomorphin、所述CHIR99021、和所述SB431542，并加入促进神经元成熟因子BDNF，脑源性神经营养因子GDNF；培养到第12天后，撤去多西环素，换为神经元维持培养基，即可得到所述多巴胺能神经元。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备多巴胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用MEFs培养基培养小鼠成纤维细胞12h后，加入Ascl1、Lmx1a、Nurr1三种转录因子进行感染，感染12-20h后，换为含有多西环素的MEFs培养基进行培养；
(2)培养3天后，换为神经元诱导培养基，所述神经元诱导培养基中包括有：成纤维细胞生长因子，转化生长因子β3，BMP抑制剂dorsomorphin，糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR9901，Shh信号通路激活剂Purmorphamine，TGFβ通路抑制剂SB431542，维生素C，ROCK抑制剂Y-27632，换培养基的当天记为第0天，诱导培养；
(3)诱导培养6天后，撤去所述神经元诱导培养基中所述dorsomorphin、所述CHIR99021、和所述SB431542，并加入促进神经元成熟因子BDNF，脑源性神经营养因子GDNF；培养到第12天后，撤去多西环素，换为神经元维持培养基，即可得到所述多巴胺能神经元。


2.根据权利要求1所述的制备多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述转录因子Ascl1、Lmx1a、Nurr1的用量比为：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)，优选为：1：1：1。


3.根据权利要求1所述的制备多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述Ascl1、Lmx1a、和/或Nurr1转录因子通过以下方法得到：
(S1)扩增小鼠的Ascl1、Lmx1a、Nurr1神经元特异性基因，并将其分别克隆到含有四环素诱导表达的慢病毒载体上；
(S2)使用293T细胞分别包装Ascl1、Lmx1a、Nurr1的慢病毒载体以及rtTA慢病毒，分别收集含有Ascl1、Lmx1a、Nurr1的病毒上清液。


4.根据权利要求3所述的制备多巴胺能神经元的方法，其特征在于，(S1)中，以小鼠的脑组织cDNA为模板，按照Ascl1、Lmx1a、Nurr1三个神经元特异性基因的特异性引物扩增，回收PCR产物，再分别利用同源重组的方法重组到由NotI和ClaI双酶切线性化...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚红杰，平王芳，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44