一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法技术

本发明专利技术提供了一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：（1）将分离培养后得到的BMSCs加入至含有川芎嗪和阿魏酸的培养液中进行干预，弃去原培养液，加入普通培养液继续培养、浓缩，得到BMSCs‑CM；（2）制备原代神经元细胞，将原代神经元细胞与BMSCs‑CM进行共培养。本发明专利技术所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法利用TMP和FA配比干预骨髓间充质干细胞生长环境，提高其旁分泌功能，促进骨髓间充质干细胞的条件培养液发挥神经元修复作用。

A method of promoting axon growth in BMSCs conditioned medium

【技术实现步骤摘要】
一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法
本专利技术属于医药领域，尤其是涉及一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法。
技术介绍
中风是世界范围内导致人类死亡和残疾的主要原因。其中，缺血性卒中约占80％。目前组织纤溶酶原激活剂(tPA)是FDA唯一批准用于治疗缺血性卒中的药物，然而，由于治疗时间窗短(3-4.5h)与治疗后出血的风险，仅有5％的患者从中获益，其临床应用仍受到限制。在此情况下，寻找一种新的治疗方法成为一大挑战。目前，干细胞疗法正在成为恢复卒中后神经功能的可行疗法。有研究者探索了不同来源的干细胞用于治疗中风的可能性和有效性。骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalstemcells,BMSCs)具有贴壁生长、低免疫原性的特点，不仅在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入和表达，在众多干细胞中脱颖而出。目前，BMSCs用于卒中的治疗潜力得到广泛的研究。BMSCs移植可以改善中风动物模型的神经和行为缺陷，刺激神经再生。在一些研究中，研究者通过静脉注射BMSCs，证明其不需要通过血脑屏障就可良好地促进神经功能恢复以及减轻脑损伤，说明了BMSCs是通过旁分泌途径及细胞间通讯机制提供旁观者效应，调节组织微环境从而诱导宿主神经修复潜能，包括分泌生长因子、免疫调节、抑制细胞凋亡、减少梗死灶周围胶质瘢痕形成、促进轴突生长和突触重塑、诱导内源性神经前体细胞增殖分化、神经和血管再生等。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，利用了BMSCs的旁分泌作用，使用川芎嗪和阿魏酸2种单体，干预下B9的条件培液达到神经修复作用。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：(1)将分离培养后得到的BMSCs加入至含有川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)和阿魏酸(Ferulicacid,FA)的培养液中进行干预，弃去原培养液，加入普通培养液继续培养、浓缩，得到BMSCs-CM(BMSCs条件培养液，conditionmedium,CM)；(2)制备原代神经元细胞，将原代神经元细胞与BMSCs-CM进行共培养。优选的，所述的步骤(1)中的培养基中的川芎嗪的浓度为1-5μM/L，阿魏酸的浓度为10-50μM/L。优选的，述的步骤(1)中的培养基中的川芎嗪的浓度为1-4μM/L，阿魏酸的浓度为10-40μM/L；优选的，所述的步骤(1)中的培养基中的川芎嗪的浓度为2μM/L，阿魏酸的浓度为20μM/L。优选的，所述的步骤(1)中的培养基中的川芎嗪与阿魏酸的浓度之比为1：(5-20)；优选的，所述的步骤(1)中的培养基中的川芎嗪与阿魏酸的浓度之比为1：10。本专利技术的另一目的在于提出一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的应用。一种川芎嗪和阿魏酸干预BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的应用。进一步，所述的神经元轴突为原代皮质神经元轴突。进一步，川芎嗪和阿魏酸诱导的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的应用。进一步，所述的川芎嗪和阿魏酸在制备用于促进神经元轴突生长的药物中的应用。进一步，所述的川芎嗪和阿魏酸在制备用于卒中后神经修复的药物中的应用。川芎嗪和阿魏酸，是川芎与当归重要药效成分。通过对川芎、当归和其有效成分进行药理研究发现，川芎嗪、阿魏酸等均在脑损病理机制的不同环节产生效应。川芎嗪可透过血脑屏障，抑制钙超载、减少细胞凋亡基因表达、抑制血小板凝集、抑制炎症反应；阿魏酸可抑制炎症反应、清除自由基、抗血栓等。通过对川芎嗪和阿魏酸进行药理研究发现，川芎嗪、阿魏酸在脑损伤病理机制的不同环节产生效应。如川芎嗪可透过血脑屏障，抑制钙超载、减少细胞凋亡基因表达、抑制血小板凝集、抑制炎症反应等；阿魏酸可抑制炎症反应、清除自由基、抗血栓等。本专利技术所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法利用TMP和FA配比干预骨髓间充质干细胞生长环境，提高其旁分泌功能，促进骨髓间充质干细胞的条件培养液发挥神经元修复作用。间充质干细胞来源的外泌体是直径在30-150nm有脂质双层膜结构的囊性小泡，内部包裹了大量蛋白质分子、DNAs、mRNAs以及miRNAs等生物活性物质，通过非细胞接触方式实现细胞间信息传递。MSCs-exosomes能够减少心肌缺血再灌注小鼠的心梗面积，MSCs通过释放大量exosomes介导了细胞通讯，从而调节了脑组织的内源性损伤后修复。外泌体中的miRNAs在脂质外膜的保护下避免了RNA酶的降解作用，性质更加稳定。进入靶细胞的每种miRNA均能对参与多个靶基因的转录后调控，同时某种关键基因又可受多个miRNA调控，因此通过miRNAs调控效应细胞中靶基因网络的表达是MSCs-exosomes发挥生物学功能的重要机制。相对于现有技术，本专利技术所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法具有以下优势：本专利技术所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法利用TMP和FA配比干预骨髓间充质干细胞生长环境，提高其旁分泌功能，促进骨髓间充质干细胞的条件培养液发挥神经元修复作用。附图说明图1为本专利技术实施例1所述的BMSCs形态学观察图；A为原代BMSCs贴壁48h，B为原代BMSCs贴壁7d，C为第三代细胞；图2为本专利技术实施例1所述的BMSCs表面标记物的流式细胞检测结果：A为CD90，B为CD29，C为CD31，D为CD45；图3为本专利技术实施例1所述的原代皮质神经元形态学观察图：A为神经元贴壁4h，B为神经元贴壁24h，C为神经元贴壁3d，D为神经元贴壁7d；图4为本专利技术实施例1所述的原代皮质神经元免疫荧光染色图：A为DAPI；B为MAP2；C为Tubline-1；D为Merge；图5为本专利技术实施例所述的促进神经元轴突生长图：A为正常组，B为正常CM组，C为TMP(1μM/L)+FA(10μM/L)组，D为TMP(2μM/L)+FA(20μM/L)组，E为TMP(4μM/L)+FA(40μM/L)组；图6为本专利技术实施例所述的TMP和FA干预BMSCs-CM促进神经元轴突生长图(*P<0.05,**P<0.01)。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例及附图来详细说明本专利技术。实施例1一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：1、制备BMSCs：(1)实验动物健康3-5周雄性清洁级SD大鼠，体重在140-160g之间，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。...

【技术保护点】
1.一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n（1）将分离培养后得到的BMSCs加入至含有川芎嗪和阿魏酸的培养液中进行干预，弃去原培养液，加入普通培养液继续培养、浓缩，得到BMSCs-CM；/n（2）制备原代神经元细胞，将原代神经元细胞与BMSCs-CM进行共培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将分离培养后得到的BMSCs加入至含有川芎嗪和阿魏酸的培养液中进行干预，弃去原培养液，加入普通培养液继续培养、浓缩，得到BMSCs-CM；
（2）制备原代神经元细胞，将原代神经元细胞与BMSCs-CM进行共培养。


2.根据权利要求1所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中的培养基中的川芎嗪的浓度为1-5μM/L，阿魏酸的浓度为10-50μM/L。


3.根据权利要求2所述的BMSCs条件培养液促进神经元轴突生长的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中的培养基中的川芎嗪的浓度为1-4μM/L，阿魏酸的浓度为10-40μM/L；优选的，所述的步骤（1）中的培养基中的川芎嗪的浓度为2μM/L，阿魏酸的浓度为20μM/L。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘璐，徐士欣，
申请(专利权)人：刘璐，徐士欣，
类型：发明
国别省市：天津;12