一种大脑皮层神经干细胞及谷氨酸能神经元的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种大脑皮层神经干细胞及谷氨酸能神经元的制备方法，涉及一种iPSC完全神经诱导培养液，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经发育因子和抑制剂。本发明专利技术提供一种iPSC完全神经诱导培养液和神经细胞培养液以及培养方法。培养液中包括无血清基础培养基、细胞添加剂、神经发育因子和抑制剂。其中，利用物血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种营养成分，如细胞添加剂和神经发育因子，能够使iPSC细胞受到信号刺激，活化iPSC细胞，促进分化。本发明专利技术提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可诱导获得高质量的神经元细胞。

A preparation method of neural stem cells and glutamatergic neurons in cerebral cortex

【技术实现步骤摘要】
一种大脑皮层神经干细胞及谷氨酸能神经元的制备方法
本专利技术属于细胞分化
，具体涉及一种大脑皮层神经干细胞及谷氨酸能神经元的制备方法。
技术介绍
自2007年山中伸弥及其团队建立了第一个人的诱导多能干细胞系(hiPSC)已达十二年之久，但是由于对控制其分化的分子机制知之甚少，这些细胞的实际应用非常有限，具体而言，从多功能hiPSC到神经外胚层细胞的分化步骤(也称为神经诱导)人们知之甚少。到目前为止，由于目前人们对神经诱导的机制仍然不甚明了，因此由胚胎干细胞定向和完全的分化为神经组织从而反应胚胎发生过程尚未实现。来自hiPSC的神经细胞的产生完全基于经验方法，例如类胚体形成，使用化学物小分子或外源基因过表达，与鼠基质细胞共培养，和hiPSC过度培养生长以获得自发分化的神经细胞。在干细胞研究领域中，众所周知这些方法是不充分的，耗费时间(用小鼠基质细胞进行的神经诱导可达4周时间)，并且产生异质细胞群，包括中胚层，内胚层和胚胎外胚层，难以获得高纯度的功能性神经干细胞及神经细胞用于临床细胞治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大脑皮层神经干细胞及谷氨酸能神经元的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一方面本专利技术提供了一种iPSC完全神经诱导培养液，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经发育因子和抑制剂。优选地，所述细胞基础培养液为DMEM/F12和NeuroBasal。优选地，所述细胞培养添加剂为B27、NEAA、Glutamax或N2中的一种或其任意组合；其中B27的浓度为0.5×～2×、NEAA的浓度为0.5×～2×、Glutamax的浓度为0.5×～2×；N2的浓度为0.5×～2×。本专利技术中的B27为购自ThermoFisher公司货号为17504044，商品名为B-27TMSupplement(50×)serumfree的商品；NEAA为购自ThermoFisher公司货号为11140050，商品名为MEMNon-EssentialAminoAcidsSolution(100×)的商品；Glutamax为购自ThermoFisher公司货号为35050061，商品名为GlutaMAXTMSupplement(100×)的商品；N2为购自ThermoFisher公司货号为17502001，商品名为N-2Supplement(100×)的商品。其中“50×”、“100×”表示商品试剂的浓度倍数，本专利技术中50×的B27表示浓度为50倍，100×的NEAA、Glutamax、N2分别表示浓度为100倍，因此，在本专利技术中使用上述试剂时以其浓度倍数计算。例如：浓度为0.5×的B27表示将浓度倍数为50×的B27商品稀释至终浓度倍数为0.5；浓度为2×的B27表示将浓度倍数为50×的B27商品稀释至终浓度倍数为2，依次类推。B27细胞培养添加剂是无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性，其主要用于神经细胞培养而不需要再添加饲养层细胞。N2细胞培养添加剂主要用于成神经细胞瘤以及周围神经系统(PNS)与中枢神经系统(CNS)的原代细胞培养中有丝分裂后期神经元的生长和表达。NEAA细胞培养添加剂含7种细胞培养所需非必需氨基酸，能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必须氨基酸的副作用，有效促进细胞增殖代谢。Glutamax细胞培养添加剂中含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在水溶液中极为稳定，储存或孵育时不会像L-谷氨酰胺一样降解为氨，因此能够最大程度降低有毒性氨的聚集，减少细胞毒性而对细胞生长有利，提高细胞活率，促进生长，进而可提高其生产效力，增加培养基稳定性。人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊要求。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此，根据神经元细胞的特性，给基础培养基中再补充特殊添加物，为神经元细胞分化提供更好的生长环境，延长其细胞活性。因此，本专利技术人经过多次尝试和改进，在基础培养基中添加上述各种细胞添加剂，获得的谷氨酸能神经元细胞活性较未添加的更好。优选地，所述神经发育因子为中期因子、多效生长因子或胰岛素样生长因子-1中的一种或其任意组合；其中中期因子的浓度为40～150ng/ml；多效生长因子的浓度为40～120ng/ml；胰岛素样生长因子-1的浓度为20～100ng/ml。优选地，所述抑制剂为RepSox、SB431542、dorsopmorphin、KY02111、Dickkopf中的一种或其任意组合；其中RepSox的浓度为2nM～5μM；SB431542的浓度为40nM～4μM；dorsomorphin的浓度为20nM～4μM；KY02111的浓度为100nM～80μM；DKK1的浓度为1μg/ml～40μg/ml。RepSox是一种有效选择性的TGFβR-1/ALK5抑制剂，能抑制ALK5自磷酸化。SB-431542也是一种有效选择性的ALK5/TGF-βtypeIReceptor抑制剂。KY02111是Wnt信号通路的抑制剂，可调节Wnt信号通路，能促进人多能干细胞向心肌细胞分化。dorsomorphin是BMP信号通路的抑制剂。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt信号通路的一种拮抗剂，DKK1在不同肿瘤中组织学和血清学的表达水平不同。本专利技术展示了在无饲养细胞的培养的单层hiPSC可直接和完全的分化为神经外胚层的关键的信号通路，并展示了未分化的hiPSC组成型表达生长和分化因子中期因子(MK)。自分泌MK在自发分化和胚状体分化期间强烈上调并且重组MK，且表现出强烈的神经诱导活性。MK在促进高PI3K和中等MAPK信号传导的平衡中起了重要作用。胰岛素样生长因子1(IGF-1)有类似的作用；多效生长因子的作用。当BMP、TGFβ超家族和经典Wnt(多能性和非神经分化的介质)信号通路同时被三个小分子(Dorsomorphin，RepSox和KY02111)阻断时，MK或IGF-1可以直接诱导hiPSC分化为专一的神经谱系。因此，本专利技术人基于上述神经细胞定向分化的细胞通路，经过多次尝试和改进，在完全神经诱导培养液中添加上述各种细胞因子和抑制剂，可实现仅在6天内产生几乎纯的神经前体细胞(NPC)培养物(>99％NESTIN+；剩余的1％为向NPC分化的过渡细胞)。然后，神经前体细胞进一步的分化可以产生一系列特定的神经元和神经胶质表型(例如，>98％MAP2+大脑皮层谷氨酸能神经元)。本专利技术还提供了一种iPSC神经细胞培养液，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经营养因子。优选地，所述细胞基础培养液为NeuroBasal。优选地，所述细胞添加物为B27、NEAA、Glutamax、N2中的一种或其任意组合，其中B27的浓度为0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经发育因子和抑制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经发育因子和抑制剂。


2.如权利要求1所述的iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，所述细胞基础培养液为DMEM/F12和/或NeuroBasal。


3.如权利要求1所述的iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，所述细胞培养添加剂为B27、NEAA、Glutamax或N2中的一种或其任意组合；其中B27的浓度为0.5×～2×、NEAA的浓度为0.5×～2×、Glutamax的浓度为0.5×～2×；N2的浓度为0.5×～2×，其中“×”表示浓度倍数。


4.如权利要求1所述的iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，所述神经发育因子为中期因子、多效生长因子或胰岛素样生长因子-1中的一种或其任意组合；其中中期因子的浓度为40～150ng/ml；多效生长因子的浓度为40～120ng/ml；胰岛素样生长因子-1的浓度为20～100ngml。


5.如权利要求1所述的iPSC完全神经诱导培养液，其特征在于，所述抑制剂为RepSox、SB431542、dorsomorphin、KY02111、DKK1中的一种或其任意组合；其中RepSox的浓度为2nM～5μM；SB431542的浓度为40nM～4μM；dorsomorphin的浓度为20nM～4μM；KY02111的浓度为100nM～80μM；DKK1的浓度为1μg/ml～40μg/ml。


6.一种iPSC神经细胞培养液，其特征在于，包括以下组分：细胞基础培养液、细胞培养添加剂、神经营养因子。


7.如权利要求6所述的iPSC神经细胞培养液，其特征在于，所述细胞基础培养液为NeuroBasal。


8.如权利要求6所述的iPSC神经细胞培养液，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌，何翠敏，
申请(专利权)人：广州瑞臻再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44