一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法。所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。本发明专利技术通过优化分化培养基的配方，以及Olig2

【技术实现步骤摘要】
A)的OPC分化计划的主要缺点为：1).在分化起点iPSC阶段就加入Retinoic Acid(RA)加速了iPSC的分化，能使OPC很快成熟，缩短分化制备时间。但是此阶段Retinoic Acid本身会导致神经干细胞的迅速脊髓化(caudalize)，所以最终制备hiOPC是脊髓亚型的OPC，功能和前脑的OPC有差异，用以治疗前脑(包括端脑和间脑，分为四个脑叶，即枕叶、顶叶、颞叶和额叶)的少突胶质细胞异常疾病时作用有限。2).终产品hiOPC纯度较低，不同iPS细胞系制备的OPC纯度从40％
‑
60％。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种分化培养基及诱导多能干细胞来源的少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法。本申请选用特定分化因子组合及其浓度和时间窗口，可以达到高效制备高纯度前脑Foxg1/Olig2阳性少突胶质祖细胞的目标，该Foxg1/Olig2阳性少突胶质祖细胞适用于少突胶质细胞的发育学的研究，新药开发(比如利用神经细胞和胶质细胞共同培养类器官)，以及再生医学，特别是前脑少突胶质细胞异常疾病的细胞补充疗法。在分化过程中，检测前脑少突胶质祖细胞的标记物Foxg1，在分化第9天，检测出Foxg1呈阳性，从而验证采用本专利技术的分化培养基可以分化出前脑少突胶质祖细胞。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]第一目的，本专利技术提供了一种分化培养基，所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；
[0008]所述基础培养基包括以下基础培养基1、基础培养基2、基础培养基3和基础培养基4中的任意一种：
[0009]基础培养基1包括以下组分：DMEM/F12、血清替代物、GlutaMAX、β
‑
巯基乙醇和非必需氨基酸；
[0010]基础培养基2包括以下组分：DMEM/F12、N2、非必需氨基酸和GlutaMAX；
[0011]基础培养基3包括以下组分：DMEM/F12、N2、B27、非必需氨基酸和GlutaMAX；
[0012]基础培养基4包括以下组分：DMEM/F12、N1、B27和GlutaMAX；
[0013]所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。
[0014]本申请的专利技术人经过大量研究及试验发现，在基础培养基中加入上述添加剂形成优选地分化培养基，可以高纯度的制备少突胶质祖细胞。
[0015]作为本专利技术所述分化培养基的优选实施方式，所述添加剂包括1
‑
5μM转化生长因子β信号传导抑制剂、1
‑
5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、1
‑
5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素、10
‑
50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5
‑
20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5
‑
200nM视黄酸、1
‑
5μM音猬因子信号通路激活剂、30
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60ng/ml三碘甲状腺素、20
‑
100ng/ml生物素、2
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10ng/ml血小板源性生长因子、5
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10ng/ml胰岛素样生长因子1和5
‑
10ng/ml神经营养素3中的至少一种。
[0016]本申请通过加入特定的添加剂及其浓度，使得制备的少突胶质祖细胞具有较高的
纯度(大于80％)，确保诱导多能干细胞向前脑亚型的少突胶质祖细胞分化，而不是向脊髓亚型少突胶质祖细胞分化，并最终分化为成熟的少突胶质细胞(O4/MPB阳性细胞)。
[0017]作为本专利技术所述分化培养基的优选实施方式，所述分化培养基包括分化培养基1
‑
6中的至少一种：
[0018]分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、1
‑
5μM转化生长因子β信号传导抑制剂和1
‑
5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂；
[0019]分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、1
‑
5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和10
‑
50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
[0020]分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和5
‑
200nM视黄酸；
[0021]分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、5
‑
200nM视黄酸和1
‑
5μM音猬因子信号通路激活剂；
[0022]分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1
‑
5μM音猬因子信号通路激活剂和5
‑
20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
[0023]分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1
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5μM音猬因子信号通路激活剂、30
‑
60ng/ml三碘甲状腺素、20
‑
100ng/ml生物素、2
‑
10ng/ml血小板源性生长因子、5
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10ng/m胰岛素样生长因子1和5
‑
10ng/ml神经营养素3。
[0024]作为本专利技术所述分化培养基的优选实施方式，所述分化培养基包括分化培养基1
‑
6中的至少一种：
[0025]分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、2μM转化生长因子β信号传导抑制剂和2μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂；
[0026]分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、2μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和20μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
[0027]分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和100nM视黄酸；
[0028]分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、100nM视黄酸和1μM音猬因子信号通路激活剂；
[0029]分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1μM音猬因子信号通路激活剂和10ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；
[0030]分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1μM音猬因子信号通路激活剂、60ng/ml三碘甲状腺素、100ng/ml生物素、10ng/ml血小板源性生长因子、10ng/ml胰岛素样生长因子1和10ng/ml神经营养素3。
[0031]本申请配制的分化培养基1
‑
6在特定的培养段内，可以在50天高效制备高纯度(＞80％)端脑亚型的少突胶质祖细胞(Foxg1+/Olig2+)。
[0032]作为本专利技术所述分化培养基的优选实施方式，所述GlutaMAX为1XGl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分化培养基，其特征在于，所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括以下基础培养基1、基础培养基2、基础培养基3和基础培养基4中的任意一种：基础培养基1包括以下组分：DMEM/F12、血清替代物、GlutaMAX、β
‑
巯基乙醇和非必需氨基酸；基础培养基2包括以下组分：DMEM/F12、N2、非必需氨基酸和GlutaMAX；基础培养基3包括以下组分：DMEM/F12、N2、B27、非必需氨基酸和GlutaMAX；基础培养基4包括以下组分：DMEM/F12、N1、B27和GlutaMAX；所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。2.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述添加剂包括1
‑
5μM转化生长因子β信号传导抑制剂、1
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5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、1
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5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素、10
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50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5
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20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2、5
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200nM视黄酸、1
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5μM音猬因子信号通路激活剂、30
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60ng/ml三碘甲状腺素、20
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100ng/ml生物素、2
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10ng/ml血小板源性生长因子、5
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10ng/ml胰岛素样生长因子1和5
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10ng/ml神经营养素3中的至少一种。3.如权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述分化培养基包括分化培养基1
‑
6中的至少一种：分化培养基1包括以下浓度的组分：基础培养基1、1
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5μM转化生长因子β信号传导抑制剂和1
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5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂；分化培养基2包括以下浓度的组分：基础培养基2、1
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5μg/ml Wnt信号通路调控因子肝素和10
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50μg/ml成纤维细胞生长因子FGF2；分化培养基3包括以下浓度的组分：基础培养基2和5
‑
200nM视黄酸；分化培养基4包括以下浓度的组分：基础培养基3、5
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200nM视黄酸和1
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5μM音猬因子信号通路激活剂；分化培养基5包括以下浓度的组分：基础培养基3、1
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5μM音猬因子信号通路激活剂和5
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20ng/ml成纤维细胞生长因子FGF2；分化培养基6包括以下浓度的组分：基础培养基4、1
‑
5μM音猬因子信号通路...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴庆玲，鲁宾雁，张怡静，区泳琪，王振煌，骆幸容，钟敏艳，张凌，何翠敏，
申请(专利权)人：广州瑞臻再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：