一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，该方法是采用酶消化法从树鼩视网膜组织中分离获得原代树鼩视网膜神经节细胞，方法实施过程中胰蛋白酶液的浓度为0.25%，细胞培养使用的培养基为含有5

【技术实现步骤摘要】
一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法


[0001]本专利技术涉及一种树鼩原代视网膜神经节细胞分离培养方法，属于细胞分离培养


技术介绍

[0002]视网膜神经节细胞( retinal ganglion cells，RGCs) 是视网膜的唯一输出神经元，对于视觉功能和昼夜节律至关重要。RGCs是将视觉感受器连接到大脑的神经视网膜元素，形成神经视觉系统，RGCs 的功能和/或形态学在几种眼部和神经系统疾病中起重要作用，眼科疾病（如视神经病、青光眼、糖尿病视网膜病变等）可导致 RGCs 损伤、变性和凋亡，都将直接导致视觉障碍和视力下降，最终引起视功能丧失，因此保持或促进 RGCs存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，建立体外视网膜神经节细胞原代培养模型，是深入研究视网膜神经节细胞病理改变过程与机制的基础与关键。
[0003]目前仅有大鼠视网膜神经节细胞、小鼠视网膜神经节细胞、人视网膜神经节细胞、猪视网膜神经节细胞被分离出，并且针对视网膜神经节细胞的特点开展了各个方向的眼科相关疾病研究。树鼩作为一种小型的攀鼩目动物，在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，已广泛应用于人类疾病模型的研究，包括病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型、代谢类疾病模型和神经系统疾病模型等，树鼩也被用于眼部、视神经以及脑部神经发育相关发生发展机制的研究。树鼩具有较大的眼睛，发达的视觉系统，锥细胞数量占感光细胞的96%，树鼩视觉相关基因也大部分与人类同源的视觉基因相关，树鼩独特的视网膜结构为研究视网膜病变提供了很好的基础。近年来，树鼩己被广泛应用于眼科疾病和视觉发育的研究，是一个潜在的有可能替代非人灵长类的实验动物。
[0004]RGCs为高度分化的细胞，增殖困难，所以只能进行原代培养，使得RGCs体外培养难度加大，随着近年来对神经节细胞的功能研究不断深入发展，以及对神经视觉系统的不断了解，RGCs体外培养越来越被需要和重视，RGCs是视网膜病变中早期发挥重要作用的细胞之一，在神经损伤对于一些疾病导致的不可逆性视力障碍中具有重要意义，但目前分离培养RGCs的研究较少，并且相关的动物组织来源也较为局限，因此建立完善多样化的RGCs体外模型越来越迫切。本专利技术采用树鼩这一新型模式动物，分离培养其RGCs，以期得到更为合适多样的细胞模型，为之后的深入研究做好铺垫，为进一步研究视网膜新生血管疾病及其病理机制奠定基础。
[0005]RGCs分离培养方法有机械分离法和酶消化法，酶消化法中的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶以及透明质酸酶等，胰蛋白酶消化法是目前原代培养RGCs的常用方法，目前不同物种以及不同实验胰蛋白酶浓度和消化时间不同，有1.25g /L胰蛋白酶消化20min、2g/L 浓度消化20min 、0.5g/L消化15min，也有25%胰蛋白酶消化15
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20min，都无法获得高产量的RGCs，且以往报道的RGCs培养方法的培养基也无法保证RGCs在体外培养中增殖以及存活率。因此克服RGCs体外分离培养现有技术的不足仍是目前需要解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，该方法是采用质量浓度0.25%胰蛋白酶消化法消化25
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35min分离得到树鼩视网膜神经节细胞，利用本方法可以快速完成分离；本专利技术使用的培养基是含5
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15ng/mLbFGF的条件重编程（CR）培养基，可以有效延长树鼩视网膜神经节细胞体外存活时间和增加传代次数，细胞可在体外培养过程中增殖生长，并保持RGCs形态。
[0007]本专利技术树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法具体步骤如下：（1）树鼩视网膜分离：取1只1岁龄树鼩的眼球，将眼球放于加入含3%青霉素/链霉素的PBS液的玻璃培养皿中，洗2
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4次，在解剖显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，用眼科显微镊去除眼球晶状体和玻璃体，剥离视网膜组织，视网膜组织用3%青霉素/链霉素的PBS中洗2
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4次，并用眼科剪剪碎；（2）制备单细胞悬液：将剪碎的视网膜放入离心管，加入0.25%胰蛋白酶液，置于 37℃、5%CO2恒温箱消化25
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35min(每隔10min摇晃离心管) ，待树鼩视网膜组织完全消化后，1000rpm离心5
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8min，去除上清液；加入DMEM/F12 培养液漂洗，1000rpm离心5
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8min，弃上清，漂洗3
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4次，收集细胞；（3）细胞培养：将步骤（2）得到的细胞加入含5
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15ng/mL bFGF的条件重编程培养基中重悬细胞，吹打混匀，接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长状况，72h后换一半新培养基，之后每隔1天换1次培养基，每天观察细胞生长状况；（4）细胞纯化：待步骤（3）中的细胞铺满瓶底时，弃培养基，用含1%青霉素
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链霉素的PBS液清洗原代细胞3
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4次，然后加入0.25% Trypsin
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EDTA胰蛋白酶液，室温消化，倒置显微镜下观察细胞，待有轴突的大部分细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打，变圆的视网膜神经节细胞被吹打下来后，将细胞悬液转至新的培养瓶中培养，显微镜下观察细胞状态；（5）对步骤（4）细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定和特异性蛋白免疫荧光鉴定，所用抗体为1:200稀释的Brn
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3a抗体（Millipore），镜下可见明显甲苯胺蓝染色和Brn
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3a荧光。
[0008]本专利技术采用的胰蛋白酶消化法分离树鼩视网膜神经节细胞，采用低浓度（0.25%胰蛋白酶）对细胞的伤害较小，分离时间25
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30min，操作简便，大大提高了分离效率；用0.25%Trypsin
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EDTA胰蛋白酶液消化RGCs细胞与消化胶质细胞存在时间差，消化时RGCs优先脱落，通过控制消化时间从而将RGCs与杂细胞分离，该纯化方法可以快速、简便的纯化RGCs。
[0009]本专利技术中使用的CR培养基适用于从健康或肿瘤组织（气道、视网膜、前列腺、乳腺、肠、胰腺、肝胆管等）增殖原代上皮细胞。以往分离RGCs多用Neurobasal Medium 培养基，但该培养基无法使细胞持续增殖。本专利技术中首次将CR培养基应用于RGCs分离，并同时添加了终浓度为5
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15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化，对神经系统有重要作用，bFGF能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，刺激胆碱乙酰化酶的合成以及突起的生长），发现该方法可使RGCs细胞增殖生长，可维持RGCs细胞形态（即细胞胞体明显，可见相互交错成网络样的轴突），同时有效延长树鼩视网膜神经节细胞体外存活时间和增加传代次数。总之本专利技术使用CR培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于：采用酶消化法从树鼩视网膜组织中分离纯化获得原代树鼩视网膜神经节细胞，原代树鼩视网膜神经节细胞培养使用含5
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15ng/mL bFGF的条件重编程培养基。2.根据权利要求1所述的树鼩视网膜神经节细胞的分离培养方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）树鼩视网膜分离：取1只1岁龄树鼩的眼球，将眼球放于加入含3%青霉素
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链霉素的PBS液中，洗2
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4次，在解剖显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，用眼科显微镊去除眼球晶状体和玻璃体，剥离视网膜组织，视网膜组织用含3%青霉素/链霉素的PBS液洗2
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4次后剪碎；（2）制备单细胞悬液：将剪碎的视网膜组织放入离心管，加入胰蛋白酶液，然后置于 37℃、5%CO2恒温箱消化25
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35min，每隔10min摇晃离心管一次，待树鼩视网膜组织完全消化后，离心去除上清液，加入DMEM/F12培养液漂洗，离心弃上清，漂洗3
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4次，收集细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆彩霞，邱敏，代解杰，王文广，李娜，孙晓梅，仝品芬，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：