一种包含胶质细胞的3D人脑类器官培养方法技术

本发明专利技术涉及一种3D人脑类器官培养方法，包括(a)培养多能干细胞以获得类胚体；(b)对来自(a)的所述类胚体进行神经诱导；(c)对来自(b)的神经诱导后的类胚体进行神经分化；(d)对来自(c)的神经分化后的类胚体进行培养，以获得3D人脑类器官；其特征在于，培养多能干细胞分成两个阶段，第一阶段的培养基包含ROCK抑制剂；第二阶段的培养基包含SMAD抑制剂、巨噬细胞集落刺激因子和细胞因子。本发明专利技术培养了一种含有胶质细胞的3D人脑类器官，并且培养过程类似生理状态下神经系统中小胶质细胞的形成过程，可为研究神经系统发育过程和神经免疫相关疾病（阿尔茨海默症、帕金森病等）提供可靠、有效的体外研究模型。效的体外研究模型。

【技术实现步骤摘要】
一种包含胶质细胞的3D人脑类器官培养方法


[0001]本专利技术涉及一种包含胶质细胞的3D人脑类器官培养方法。

技术介绍

[0002]3D人脑类器官是能够在体外培养条件下模拟人脑早期发育的有效模型，由人诱导 多能干细胞诱导分化形成。目前已经投入科学研究的3D人脑类器官有人全脑类器官、 前脑类器官、中脑类器官和海马体等。
[0003]培养成熟的3D人脑类器官包含多种细胞类型。例如，培养成熟的全脑类器官中， 包含神经祖细胞、成熟神经元、GABA能神经元和谷氨酸能神经元等。但是，多项研究 表明，体外培养的3D人脑类器官中缺乏小胶质细胞。
[0004]胶质细胞是人脑组织中主要的细胞类型之一，包含小胶质细胞、星形胶质细胞和少 突胶质细胞。胶质细胞在维持神经系统功能中起到至关重要的作用。小胶质细胞是神经 系统中的常驻免疫细胞，在中枢神经系统(CNS)中作为免疫防御的“第一线”细胞发 挥着重要作用。活化的小胶质细胞可以充当抗原呈递者并分泌细胞因子来触发后续的免 疫反应，能够检测并吞噬受损的细胞、病毒、细胞碎片和细菌等。由于它们具有监测和 清除中枢神经系统中有害物质的多方面能力，因此小胶质细胞对于神经系统损伤修复至 关重要，并与神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病)有关。小胶质细胞在大脑发 育过程中对于树突状修剪至关重要，而在成熟的大脑中，它们有助于维持神经系统稳态 平衡环境。星形胶质细胞是中枢神经系统中胶质细胞类型之一，参与调控生理状态和病 理状态下神经系统的多个生命进程。在健康神经系统环境中，星形胶质细胞在发育、血 流调节(通过支持血脑屏障内皮细胞)、突触传递和功能，以及能量和代谢(通过为神 经元提供营养以及合成某些神经递质)中起到重要作用。星形胶质细胞功能丧失或异常 与多种神经退行性疾病过程有关。星形胶质细胞的慢性激活会导致与阿尔茨海默病和亨 廷顿氏舞蹈病中观察到的病变相似的表型。少突胶质细胞是会产生髓磷脂的高度特化胶 质细胞类型，髓磷脂是能够为轴突提供保护鞘，并提高神经元间的信号传导速度的一种 富含脂质的物质。少突胶质细胞祖细胞存在于脑中，可促进损伤引起的细胞再生。然而， 髓磷脂分解和无法完整再生有髓少突胶质细胞与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨 海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和多发性硬化症(MS)。 因此，胶质细胞在神经免疫、神经系统发育、稳态维持、突触修剪、突触传递和神经系 统疾病中扮演重要角色。
[0005]因此，想要使体外环境下培养的3D人脑类器官能够在最大程度上模拟体内人脑的 发育特征和过程，建立一种方法，能够培养出包含神经胶质细胞的3D人脑类器官就显 得至关重要和紧迫。
[0006]现有技术形成包含小胶质细胞3D人脑类器官主要有以下几种方式：
[0007]1.从人胚胎脑中分离出原代小胶质细胞，并与构建好的3D人脑类器官共培养。随 着培养时间的延长，共培养体系中小胶质细胞会逐渐迁入到3D人脑类器官中，形成包 含小胶质细胞的神经免疫类器官。但是，迁入到3D人脑类器官中的小胶质细胞数量较 少，且培
养时间越长，小胶质细胞的数量越少(如图1,Galina Popova et al.,Cell Stem Cell, 2021.)。
[0008]2.人诱导多能干细胞(hiPSCs)诱导分化形成小胶质细胞，并与构建好的3D人脑 类器官共培养。随着培养时间的延长，共培养体系中小胶质细胞会逐渐迁入到3D人脑 类器官中，形成包含小胶质细胞的神经免疫类器官。但是，迁入到3D人脑类器官中的 小胶质细胞数量较少，且培养时间越长，小胶质细胞的数量越少(如图2，Galina Popovaet al.,Cell Stem Cell,2021.)。
[0009]以上两种方式分别从人胚胎脑中分离出原始小胶质细胞、hiPSCs诱导分化形成小胶 质细胞，之后将小胶质细胞与3D人脑类器官共培养，小胶质细胞迁入到3D人脑类器 官中，形成神经免疫类脑模型。但是，这两种方法形成的神经免疫类脑器官仍存在不可 忽视的缺陷。
[0010]这两种方法中，形成的神经免疫类脑中包含的小胶质细胞数量较少。在第二周小胶 质细胞数量最多的时候，每张类脑切片也只有25个细胞，且随着培养时间的延长，小 胶质细胞的数量逐渐下降。共培养到第5周时，每张类脑切片中的小胶质细胞数量仅仅 只有5个左右了。这种方法培养出的神经免疫类脑器官中，小胶质细胞的比例远远低于 正常人脑中小胶质细胞的比例，正常人脑中小胶质细胞的比例约为总细胞数量的 5％
‑
15％。
[0011]另外，这两种形成神经免疫类脑器官的方法，不符合人脑发育过程中小胶质细胞的 形成过程。生理状态下，小胶质细胞由中胚层发育而来。胚胎发育过程中，原肠胚形成 三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)，中胚层干细胞在集落刺激因子(M
‑
CSF、G
‑
CSF) 和细胞因子IL
‑
34等的诱导下，促使胚胎干细胞分化形成小胶质细胞前体细胞，这些小 胶质细胞前体细胞迁移到发育中的神经组织中并最终形成成熟小胶质细胞。
[0012]3.hiPSCs诱导分化形成包含小胶质细胞的3D人脑类器官。2018年，Paul R.Ormel 等人从hiPSCs出发，诱导形成了包含小胶质细胞的人3D人脑类器官(如图3，Paul R. Ormel et al.,nature communication,2018)。
[0013]在该方法中，第1
‑
6天，hiPSCs在类胚体形成培养液的刺激作用下，自组织形成了 类胚体，类胚体中包含中胚层、内胚层和外胚层。在第6天时，将培养液更换为神经外 胚层诱导培养基，诱导类胚体中神经外胚层祖细胞形成。之后，在第13天时，将培养 液更换为神经分化培养基，在神经分化培养基的作用下，神经外胚层祖细胞分化形成神 经细胞祖细胞，并进一步分化形成神经细胞。而在此过程中，中胚层祖细胞可能在细胞 释放的细胞因子的刺激作用下分化形成小胶质细胞。尽管该方法培养出包含小胶质细胞 的3D人脑类器官，其小胶质细胞(IBA1阳性细胞)在类脑切片中的比例仅为5.99％
±ꢀ
1.65％，低于正常人脑中小胶质细胞的平均比例。且该方法中类胚体在分化到后期时， 类胚体中包含多种其他胚层分化而来的复杂的细胞类型。而在生理状态下，脑组织中主 要由神经细胞和胶质细胞组成，在血脑屏障的保护下，其他细胞类型是不可能存在于脑 组织中的。
[0014]因此，如果以该模型来模拟人脑发育过程，以及以该模型开展神经相关的研究(例 如，AD,PD等)，可能导致研究结果出现严重偏差或者出现完全不存在结果。因此，开 发一种近似生理状态下脑组织神经系统中小胶质细胞形成的方法至关重要。

技术实现思路

[0015]本专利技术的目的是开发一种能够培养出近似生理状态下脑组织神经系统中小胶质细 胞状态的3D人脑类器官方法。
[0016]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含胶质细胞的3D人脑类器官的培养方法，包括：(a)培养多能干细胞以获得类胚体；(b)对来自(a)的所述类胚体进行神经诱导；(c)对来自(b)的神经诱导后的类胚体进行神经分化；(d)对来自(c)的神经分化后的类胚体进行培养，以获得3D人脑类器官；其特征在于，培养多能干细胞分成两个阶段，第一阶段的培养基包含ROCK抑制剂；第二阶段的培养基包含SMAD抑制剂、巨噬细胞集落刺激因子和细胞因子。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述SMAD抑制剂包含SB431542和LDN193189。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第二阶段的培养基包含基础培养基和第二特异性添加因子；所述第二特异性添加因子包括以下终浓度的组分：血清替代物，10%
‑
20%；成纤维细胞生长因子，4
‑
8 ng/ml；谷氨酰胺补充剂，1
‑
2x；非必需氨基酸补充剂，1
‑
2x；抗生素，1
‑
2x；巨噬细胞集落刺激因子，10
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20 ng/ml；细胞因子，100
‑
200 ng/ml；SMAD抑制剂，1
‑
12μM。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，采用第三培养基培养(b)中所述自(a)的所述类胚体；所述第三培养基包含SMAD抑制剂、用于细胞增殖的补充剂和用于扩增未分化细胞的补充剂。5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述第三培养基包含基础培养基和第三特异性添加因子；所述第三特异性添加因子包括以下终浓度的组分：成纤维细胞生长因子，4
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8 ng/ml；谷氨酰胺补充剂，1
‑
2x；非必需氨基酸补充剂，1
‑
2x；抗生素，1
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2x；SMAD抑制剂，1
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12μM；用于细胞增殖的补充剂，1 μg/ml；用于扩增未分化细胞的补充剂，1
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2x。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒙庆团，陈超，刘春宇，唐北沙，张文雕，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：