一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，所述的小分子化合物组合包括：CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632，用于诱导皮肤成纤维细胞向神经元的转分化，修复长距离外周神经缺损及中枢神经损伤。本发明专利技术的转分化技术可以高效获得神经元，并将其移植到脊髓损伤的动物模型后获得显著的疗效，通过运动能力改善，皮层诱发电位恢复等指标得出，本发明专利技术为脊髓损伤在内的相关神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。

Combination and application of a small molecular compound to induce direct transdifferentiation of skin fibroblasts into neurons

【技术实现步骤摘要】
一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合及应用
本专利技术涉及生物技术和神经发育领域，具体涉及一种诱导成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合及其用途。
技术介绍
由于终末分化的神经元不能再生，中枢神经系统损伤不可逆。尽管干细胞具有分化为包括神经元在内的多种神经细胞的潜能，干细胞疗法也被认为是一种很有前景的中枢神经系统损伤修复解决方案，但研究表明移植到受损组织中的神经干细胞更容易分化为星形胶质细胞或少突胶质细胞，很少分化为功能性神经元。此外，干细胞移植应用仍面临几个主要障碍，包括肿瘤形成、移植物排斥和伦理问题。因此，找到治疗神经损伤和神经系统疾病更合适的治疗方法至关重要。神经科学和细胞生物学的发展已经为获得神经元提供了多样化的解决方案。与诱导干细胞分化相比，将体细胞直接重编程为不经过干细胞状态的神经元具有显著优势，如分化效率高，诱导周期短，无伦理问题，潜在致瘤风险低等。用于神经元重编程的主要方法包括小分子诱导、转录因子和或miRNA转导以及外泌体转运等，已被用于将体细胞转分化为相应神经疾病所需的各种神经元亚型。出于对临床应用的安全性考虑，基于小分子的重编程比转基因方法更具有优势，后者具有外源DNA序列基因组插入的风险。小分子是细胞可渗透的和非免疫原性的，易于合成、保存、标准化和操作，并且成本低。此外，它们的生物学效应快速且通常是可逆的，并且可以通过不同的浓度和组合精确控制。最近，越来越多的研究表明，纯化合物即可诱导各种体细胞向神经细胞转分化。皮肤成纤维细胞是组织工程的优秀种子细胞，具有来源丰富、分布广泛、体外扩增能力强和便于自体移植等优点。研究表明，通过小分子诱导可以将不同来源和不同种属的成纤维细胞重编程为神经元，甚至是功能性神经元亚型。总之，安全有效的小分子诱导的神经元重编程方法具有巨大的临床应用潜力。脊髓损伤（SCI）是由创伤性损伤或非创伤性损伤（如感染和肿瘤）引起的一种严重且不可逆的病状。SCI后的永久性功能和神经功能缺损以及再生能力有限归因于许多继发性细胞和分子反应，例如神经胶质和神经元细胞死亡，轴突丧失，脱髓鞘，炎症，坏死腔，神经胶质瘢痕形成和神经营养因子缺乏。尽管已被广泛研究，但仍没有有效的临床治疗方法SCI。一种有希望的治疗策略旨在通过细胞移植替代失去的神经元，并与宿主神经元重建新的神经元回路。
技术实现思路
要解决的技术问题：本专利技术的目的是提供一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，用于诱导皮肤成纤维细胞向神经元的转分化，用来修复长距离外周神经缺损及中枢神经损伤。技术方案：一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，所述的小分子组合包括：CHIR99021（GSK-3抑制剂），Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂），LDN193189（BMP信号抑制剂），SB431542（选择性ALK5/TGF-βI型受体抑制剂），SP600125（可逆且具有ATP竞争能力的JNK抑制剂），VPA（组蛋白脱乙酰基酶1的抑制剂）和Y27632（ROCK-I和ROCK-II的ATP竞争性抑制剂）。优选的，所述CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632的摩尔比为（0.1-3）：（0.5-20）：（0.01-0.25）：（0.1-5）：（0.1-10）：（100-1000）：（0.1-30）。优选的，所述CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632的摩尔比为3：50：0.1：2：10：500：5。优选的，所述小分子化合物组合用于将皮肤成纤维细胞转分化为神经元，或用于制备将皮肤成纤维细胞转分化为神经元的药物组合物。上述的小分子化合物组合在诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的应用。优选的，所述皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。有益效果：本专利技术的诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合具有以下优点：1、筛选获得的小分子组合CFLSSVY（CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632）以往并无报道，为首次证实该组合高效率诱导转分化效应，CFVLSSY诱导获得了较高的神经元阳性率（即Tubb3阳性率），在分化7天时，Tubb3阳性的细胞高达82.09±1.07%，分化14天后，Tubb3阳性细胞进一步增加，达到87.03±1.03%（图1和图3B）。此外，此小分子组合也能高效诱导小鼠和人的皮肤成纤维向神经元的转分化，为60%和50%左右（图3C），本专利技术筛选的CFLSSVY的诱导转化率较高，高于现有同等技术中的转化率；2、本专利技术的转分化技术可以高效获得神经元，并将其移植到脊髓损伤的动物模型后获得显著的疗效，通过运动能力改善，皮层诱发电位恢复等指标得出，本专利技术为脊髓损伤在内的相关神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。附图说明图1.本专利技术诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子组合筛选，筛选出CFLSSVY；图2.筛选获得的小分子组合CFLSSVY诱导大鼠皮肤成纤维细胞（RDFs）分化方案示意图；图3.小分子组合CFLSSVY诱导大鼠、小鼠和人的皮肤成纤维转分化为神经元前成纤维特异性标志物Vimentin和S100A4以及转分化后神经元特异性标志物Tubb3的免疫荧光染色检测及Tubb3阳性细胞比例的统计；图4.Tubb3启动子报告系统载体示意图以及转分化诱导后细胞中mcherry的表达情况及其流式细胞术检测；图5.RDFs经诱导转分化14d和28d后，成熟神经元特异标志物NeuN和Synapsin-1的免疫荧光检测；图6.CFLSSVY诱导RDFs转分化为神经元过程中成纤维相关基因及神经元相关基因的表达变化；图7.RDFs转分化获得的神经元与载体3D丝素蛋白支架一起移植到大鼠受损脊髓促进后肢运动能力恢复，表现为移植化学诱导的神经元CiNs组（3D-SF-CiNs）Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分显著高于对照组（sham，SCI和3D-SF），并在45°倾斜栅格测试视频的连续延时帧中显示了两个后肢之间的协调性，其中，Sham为只敲除椎板未伤及脊髓的假手术组，SCI为脊髓损伤不处理组，3D-SF为移植单纯丝蛋白支架组，3D-SF-CiNs为移植载有CiNs的丝蛋白支架组；图8.神经元组（3D-SF-CiNs）移植入大鼠脊髓缺损后皮层运动诱发电位与其他对照组相比潜伏期较短，电压幅度较大，指示恢复较好，其中，SCI为神经损伤不处理组，3D-SF为单纯丝蛋白组，3D-SF-CiNs为移植载有CiNs的丝蛋白支架组；图9.脊髓损伤后单独3D丝素蛋白支架和载着CiNs的3D丝素支架蛋白植入大鼠脊髓缺损后切片的H&E染色及各组脊髓空洞面积检测，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，其特征在于，所述的小分子化合物组合包括：CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，其特征在于，所述的小分子化合物组合包括：CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632。


2.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞直接向神经元转分化的小分子化合物组合，其特征在于：所述CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632的摩尔比为（0.1-3）：（0.5-20）：（0.01-0.25）：（0.1-5）：（0.1-10）：（100-1000）：（0.1-30）。


3.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡雅楠，张焕相，张锋，杨敏，何其圣，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32