一种对神经细胞进行诱导培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种对神经细胞进行诱导培养的方法，包括如下步骤：1)制备神经细胞悬浮液；2)准备石墨烯薄膜，石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养。本申请提供的神经细胞的诱导培养方法，通过将表面具有沟槽状结构石墨烯薄膜作为神经细胞的培养基底材料，使得神经细胞能够被诱导沿其若干个沟槽线性定向的生长，提高神经细胞培养效率。

A method of inducing and culturing neural cells

【技术实现步骤摘要】
一种对神经细胞进行诱导培养的方法
本专利技术属于生物细胞培养
，具体涉及一种对神经细胞进行诱导培养的方法。
技术介绍
神经细胞的定向分化生长对于伤口愈合、神经修复等有重要意义。而现有技术中多采用细胞培养皿进行细胞培养，使用时将细胞悬浮液注入培养皿，再置于二氧化碳培养箱中静置培养，促使细胞贴壁生长。但上述培养方式生长的细胞杂乱无序，并且生长速度仅能够依靠细胞本身，显然不适用于对神经细胞培养以及定向生长的实验研究。石墨烯具有由碳原子通过sp2杂化形成的二维纳米结构的六角形的蜂巢状结构，此种独特的结构赋予了石墨烯独特的物理及电学等特性、优良的机械性能、导电性、较大的比表面积以及良好的生物相容性等，可以作为神经修复材料进行应用。目前，现有技术中已经将石墨烯用于细胞培养，如CN208748112U和CN208776741U均利用了石墨烯的导热性，将石墨烯作为加热膜用于细胞培养或观测的系统中；CN10243304A提供了一种石墨烯衬底，可以适用于肿瘤细胞、原代神经细胞以及神经干细胞的生长；CN207877745U提供了一种生物细胞培养器皿，其接触培养细胞的界面设有石墨烯玻璃。专利文献CN110467177A以及文献[1]中还提供了一种双面的三维石墨烯支架，并可用于神经细胞的分化，但其制备方法非常复杂繁琐不易操作，并且获得的石墨烯支架壁厚特别薄，只有单层或几层石墨烯，精度过小，无疑加大了实际应用的难度([1]马迅，可控石墨烯支架对神经祖细胞的生物学研究[D].2019.5.)。上述方案中虽然都将石墨烯用于细胞培养，但仍没有提供一种快速便捷、实用性强，同时还能促使神经细胞定向生长的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术旨在提供一种能够促进神经细胞快速生长、提高神经细胞培养效率，并且还能够对神经细胞进行定向分化、线性生长的诱导培养方法，所述方法包括如下步骤：1)制备神经细胞悬浮液；2)准备石墨烯薄膜，所述石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养；其中，所述步骤2)中的石墨烯薄膜采用以下方法制备：以片径2μm的氧化石墨烯分散液为原料，抽滤制成氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有沟槽状表面的硅胶模板，将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在用水润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可。上述神经细胞的诱导培养方法，采用石墨烯材质的培养基底对神经细胞无毒无害，并对神经细胞的生长培养起到一定的促进作用；与此同时，石墨烯薄膜表面的沟槽状结构，有利于诱导细胞沿其沟槽结构线性定向的生长。其中石墨烯薄膜的制备方法利用了表界面效应，实现了介观尺度下石墨烯薄膜的可操控自定义图案制作，并且操作简单易行。进一步地，所述步骤1)中神经细胞悬浮液的制备方法包括：将神经细胞收集在培养液中，用酶溶液在37℃下处理30分钟，研磨并离心，再将神经细胞重新悬浮于所述培养液，获得神经细胞悬浮液。更进一步地，所述培养液包括90％培养基，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素；所述酶溶液为含有5mg/ml蛋白酶和1mg/mlI型胶原酶的磷酸缓冲液。进一步地，所述步骤2)中石墨烯薄膜表面的沟槽状结构包括若干个沟槽，单个沟槽的宽度为5-200μm，优选10-100μm，更优选15-100μm，更优选20-50μm，单个沟槽的深度为10-50μm，优选20-50μm，更优选20μm。进一步地，所述石墨烯薄膜的厚度为8-12μm。进一步地，相邻的所述单个沟槽之间具有线性凸起，所述线性凸起的内部中空贯通。优选的，所述线性凸起的高度为10-50μm，优选15-40μm，更优选20-30μm，更优选20-25μm，更优选20μm；线性凸起的宽度为20-100μm，优选20-80μm，更优选20-60μm，更优选20-50μm。线性凸起结构的设置一方面可以简化沟槽状结构的制备方法，例如，使得具有一定厚度的片层状石墨烯的部分片层，沿薄膜厚度方向上凸起延伸即可，而无需对其进行刻蚀，另一方面，还可以用于装载促细胞生长因子或胶质细胞源性神经营养因子，例如NGF、NT-3、NT-4、BDNF等，提高神经细胞生长培养效率。此外，沟槽状结构的尺寸范围与大多数细胞的尺寸相匹配，有利于诱导神经细胞沿沟槽的设定方向定向生长。进一步地，所述步骤3)还包括：向所述装载神经细胞的石墨烯薄膜施加电刺激。进一步地，所述装载神经细胞的石墨烯薄膜外接有0.1mA的恒流电源，以用于施加电刺激。如此设置利用了石墨烯的导电性，以使得能够直接对置于其中的神经细胞施以电刺激，促进其生长分化。进一步地，所述步骤3)中石墨烯薄膜具有沟槽状图案的表面还涂有细胞贴壁生长促剂，以促使生物细胞在石墨烯薄膜表面贴壁生长。更进一步地，所述细胞贴壁生长促剂包括聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白。进一步地，所述步骤4)还包括：向装载神经细胞的石墨烯薄膜添加神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。进一步地，所述神经细胞包括背根神经节细胞。其中，背根神经节细胞可以来源于人源或鼠源，优选为鼠源，更优选为3-6周龄大的C57BL/6小鼠。在一种实施方式中，上述石墨烯薄膜可以通过以下方法制备获得：以片径2μm的2mg/ml氧化石墨烯分散液为原料，利用抽滤法制成厚度10μm的氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有微米尺度的图案化表面的硅胶模板，通过将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可得到表面具有沟槽状结构图案的石墨烯薄膜。本专利技术的有益效果是：本申请提供的神经细胞的诱导培养方法，通过将表面具有沟槽状结构石墨烯薄膜作为神经细胞的培养基底材料，使得神经细胞能够被诱导沿其若干个沟槽线性定向的生长，此外，还利用了石墨烯本身的导电性为神经细胞的诱导培养施加电刺激，进一步促进细胞快速生长、提高细胞培养效率。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为本申请提供的对神经细胞诱导培养的方法使用的装置结构示意图；图2为石墨烯薄膜的表面结构示意图；图3为背根神经节细胞在不同石墨烯薄膜上生长效果的共聚焦激光扫描显微镜图，其中图a为对比例1所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图b为对比例2所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图c为实施例1所得的共聚焦激光扫描显微镜图，图d为实施例2所得的共聚焦激光扫描显微镜图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对神经细胞进行诱导培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n1)制备神经细胞悬浮液；/n2)准备石墨烯薄膜，所述石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；/n3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；/n4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养；/n其中，所述步骤2)中的石墨烯薄膜采用以下方法制备：以片径2μm的氧化石墨烯分散液为原料，抽滤制成氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有沟槽状表面的硅胶模板，将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在用水润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种对神经细胞进行诱导培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)制备神经细胞悬浮液；
2)准备石墨烯薄膜，所述石墨烯薄膜的表面具有沟槽状结构的图案；
3)以步骤2)获得的石墨烯薄膜为培养基底材料，将步骤1)获得的神经细胞悬浮液涂布于所述步骤2)获得的石墨烯薄膜具有沟槽状结构图案的表面，以获得装载神经细胞的石墨烯薄膜；
4)将步骤3)获得的装载神经细胞的石墨烯薄膜置于培养箱中培养；
其中，所述步骤2)中的石墨烯薄膜采用以下方法制备：以片径2μm的氧化石墨烯分散液为原料，抽滤制成氧化石墨烯薄膜；再利用倒模的方法制备具有沟槽状表面的硅胶模板，将干燥后的氧化石墨烯薄膜平铺在用水润湿的硅胶模板上，静置晾干成型；使用碘化氢溶液和无水乙醇配制成的还原液对成型的氧化石墨烯薄膜进行还原后，取下薄膜清洗干净即可。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中神经细胞悬浮液的制备方法包括：将神经细胞收集在培养液中，用酶溶液在37℃下处理30分钟，研磨并离心，再将神经细胞重新悬浮于所述培养液，获得神经细胞悬浮液。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养液包括90％培养基，10％胎牛血...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，王国航，栗国贝，孙冰冰，
申请(专利权)人：天新福北京医疗器材股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11