含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用制造技术

本发明专利技术提供一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用。所述体系包含聚苯乙烯微纳小球(C

In vitro culture system and application of hematopoietic stem cells containing polymer microspheres

【技术实现步骤摘要】
含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，以及聚合物微纳小球用于造血干细胞离体高效扩增的方法。
技术介绍
干细胞(StemCell)是一类具有自我更新能力和多重分化潜能的细胞，这种特性使其成为再生医学和组织功能领域不可缺少的种子细胞来源。干细胞也是众多疾病中，例如血液疾病、神经系统损伤、肿瘤、心脏病等细胞治疗的最佳候选，因此对于干细胞的研究在临床领域意义重大。造血干细胞(HematopoieticStemCell,HSC)主要存在于骨髓中，具有自我更新和产生所有造血系统成熟细胞谱系的能力。因此造血干细胞移植在许多恶性血液病治疗中具有广阔的应用前景，例如白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、骨髓异常增生综合征等。临床上获取造血干细胞的途径包括骨髓、脐带血和动员后的外周血，然而造血干细胞有限的来源限制了其在临床治疗上的广泛应用。例如，单份脐带血中CD34+造血祖细胞(HSPC)绝对数目不足，难以满足成年或体重较大的儿童患者移植所需的细胞量；骨髓采集由于创伤性大已基本淘汰，且骨髓及动员后外周血来源的造血干细胞必须寻找HLA匹配的供者，也给临床治疗增加了难度和负担。若能增加移植物中造血干细胞的数量，促进移植后造血系统的重建，必然会增加造血干细胞移植的成功率和应用。因此，探索和发展造血干细胞的体外扩增新方法具有重大需求，而目前促进造血干细胞体外扩增的方法有待改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，所述造血干细胞体外培养体系，包含聚苯乙烯微纳小球(C8H8)n(聚合度n为500-2500)、组合物和StemSpanTM无血清培养基，其中聚苯乙烯微纳小球是指已苯乙烯为单体合成的聚合物小球，其粒径范围在50nm至10μm之间，组合物由以下组分组成：干细胞生长因子(StemCellFactor,SCF)、血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)、肝素，StemSpanTM无血清培养基购自STEMCELLTechnologiesInc，货号为#09650。所述聚苯乙烯微纳小球分散介质为超纯水，保存条件为室温干燥，粒径范围在50nm-10μm，Zeta电位范围在-0.064至-0.306mV。组合物与StemSpanTM无血清培养基分开于不同的容器中，放置于-80℃保存。聚苯乙烯微球被配制于IMDM培养基中，放置于4℃一周内使用。所述组合物中各组分的添加浓度为：SCF(10ng/mL)、TPO(20ng/mL)、肝素(10μg/mL)。所述聚苯乙烯微纳小球的添加浓度为0.5-20μg/mL。优选添加浓度为1μg/mL。本专利技术的另一个目的是提供所述体外培养体系在小鼠造血干细胞离体高效扩增培养中应用。是一种用于小鼠骨髓造血干细胞高效扩增的体外培养方法，通过采用CCK-8法、流式细胞分析技术、克隆形成实验测试了添加不同浓度、粒径的聚苯乙烯微纳小球对造血干细胞数目与功能的促进作用。本专利技术体外扩增培养具体通过以下方法实现：(1)聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外扩增的培养体系：分离小鼠骨髓原代细胞，在添加有组合物SCF(10ng/mL)、TPO(20ng/mL)、肝素(10μg/mL)的StemSpanTM无血清培养基中培养，添加浓度为0.5-20μg/mL与粒径范围在50nm至10μm的聚苯乙烯微纳小球，继续培养7-14天后测试造血干细胞的扩增效果；(2)应用CCK-8法测定不同浓度聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞的增殖促进作用：添加浓度为0.5-20μg/mL的聚苯乙烯微纳小球，继续培养后测试增殖效果，结果显示0.5-5μg/mL的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著促进小鼠骨髓细胞的增殖；(3)应用流式细胞分析技术检测不同粒径的聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞中造血干细胞的扩增作用：添加粒径范围在50nm至10μm的聚苯乙烯微纳小球，浓度为1μg/mL；继续培养后收集细胞，使用造血干细胞标志物流式抗体染色后，上机分析造血干细胞比例和数目的变化，结果显示50nm、100nm、500nm、2μm、5μm和10μm的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著提升小鼠骨髓细胞中造血干细胞的比例与数目；(4)应用克隆形成实验检测不同粒径的聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外功能的作用：添加粒径为50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微纳小球，浓度为1μg/mL；继续培养后收集细胞，在半固体培养基中培养14天后，显微镜下观察造血干细胞克隆形成数目，结果显示50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著提升小鼠造血干细胞的体外功能；本专利技术公开了一种聚合物微纳小球对造血干细胞体外培养、扩增及功能的促进作用。所述的聚合物微纳小球以一定剂量添加于小鼠造血干细胞培养体系中，能够实现在10天内对LSK(Lin-Sca1+c-Kit+)和SLAMHSC(Lin-Sca1+c-Kit+CD150+CD48-)的大量扩增，且无毒副作用。本专利技术同时添加聚苯乙烯微纳小球与组合物(细胞因子)用于小鼠造血干细胞体外培养，对造血干细胞的扩增效果大于只添加细胞因子组合物。本专利技术对于造血干细胞移植、体外扩增等临床及科研领域具有极大的应用潜力。附图说明图1是采用扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)表征，测定的部分聚苯乙烯微纳小球水合粒径、多分散系数、Zeta电位；图2是采用细胞活力实验测定不同浓度聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞的增殖效果；聚苯乙烯微纳小球的使用浓度分别为0.5、1、2、5、10和20μg/mL，培养时间为别为A：3、B：7、C：14天。图3是采用流式细胞分析技术测定不同尺寸聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞中造血干细胞的扩增效果，聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，从左到右依次为对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球。图4是采用流式细胞分析技术测定对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球对小鼠骨髓细胞中LSK(Lin-Sca1+c-Kit+)和SLAMHSC(Lin-Sca1+c-Kit+CD150+CD48-)占总细胞比例的统计结果。其中聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，每组三次重复。图5是采用流式细胞分析技术测定对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球对小鼠骨髓细胞中LSK(Lin-Sca1+c-Kit+)和SLAMHSC(Lin-Sca1+c-Kit+CD150+CD48-)总数的计数统计结果。其中聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，每组三次重复。图6采用克隆形成实验(Colony-FormationUnit)测定不同尺寸聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外分化功能的作用，其中BFU-E、G、M、GM、GEMM分别代表造血干细胞分化后形成不同谱系血细胞的克隆。...

【技术保护点】
1.一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，其特征在于，所述造血干细胞体外培养体系，由聚苯乙烯微纳小球、组合物和StemSpan

【技术特征摘要】
1.一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，其特征在于，所述造血干细胞体外培养体系，由聚苯乙烯微纳小球、组合物和StemSpanTM无血清培养基组成，其中聚苯乙烯微纳小球，其粒径范围在50nm至10μm之间，组合物由以下组分组成：干细胞生长因子、血小板生成素、肝素。


2.根据权利要求1所述的一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，其特征在于，所述聚苯乙烯微纳小球分散介质为超纯水，保存条件为室温干燥，粒径范围在50nm-10μm，Zeta电位范围在-0.064至-0.306mV。


3.根据权利要求1所述的一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，其特征在于，所述组合物中各组分的添加浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱鹏旭，王琪炜，韩颖丽，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33