一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用，本发明专利技术针对乌斑鳢脑组织细胞的特征，采用胶原酶I和胰酶联合消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了乌斑鳢脑细胞系，已连续传至100代以上，可提供大量的乌斑鳢脑来源细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。乌斑鳢脑细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，而且乌斑鳢脑细胞系还可用于鳢源舒伯特气单胞菌的黏附特性研究，可以直接应用于病原特性研究及疫苗研制。

A brain cell line of ophiocephalus Argus and its construction and Application

The invention discloses a brain cell line of ophiocephalus Argus and its construction method and application. According to the characteristics of brain tissue cells of ophiocephalus Argus, the invention adopts collagenase I and pancreatin combination digestion method to separate brain tissue cells and carry out primary culture, and then successfully constructs the brain cell line of ophiocephalus Argus, which has been continuously transmitted to more than 100 generations, and can provide a large number of brain source cells of ophiocephalus Argus, and the cells can be maintained It has good growth state and can be frozen. The brain cell line of ophiocephalus Argus is sensitive to a variety of fish viruses, and all of them have cytopathic changes after receiving the virus. Moreover, the brain cell line of ophiocephalus Argus can also be used for the study of adhesion characteristics of Aeromonas Schubert from ophiocephalus Argus, and can be directly used for the study of pathogenic characteristics and vaccine development.

【技术实现步骤摘要】
一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用。
技术介绍
乌鳢和斑鳢都是比较常见的经济鱼类，两者同属于鲈形目(Perciformes)、鳢亚目(Channoidei)、鳢科(Channidae)。乌鳢俗名为黑鱼，生性比较凶猛、好斗，繁殖力强，多分布于长江流域及以北一带的水系，而斑鳢主要分布在长江流域以南地区，例如广东、海南、广西、福建、云南等。乌斑鳢的父本大多数来自湖南省、山东省等地区的乌鳢，而其母本则多是广东省本土的斑鳢，将两者杂交培育出的子一代即称为乌斑鳢，这类杂交技术属于鱼类远缘杂交的种间杂交。申请人成功培育出第一条乌斑鳢。个体具有明显的杂交优势，不仅个体生长速度快，肌肉品质和营养价值都很高，此外，成年个体体型大还具有较强的抗病能力，可生活在低氧环境下和饵料系数也相对较低等优势。在自然环境下，鳢科鱼类的自身的抗病能力十分强，几乎不会出现发病现象。但是，随着鳢科鱼类养殖的集约化程度不断提高、养殖规模和养殖密度的逐步扩大，鳢科鱼类发生传染病的情况日趋增多。随着各种病害的频繁发生，细菌性和病毒性疾病的暴发，制约了鳢科鱼类养殖业快速的发展和推广。为了进一步了解乌斑鳢感染病毒的机制，需要建立一株敏感性较高的细胞系，为今后进行病毒类疾病的诊断和病毒疫苗的研制打下基础。鱼类原代细胞系的建立目前是一种较为成熟的技术，但是要获得一株对病毒敏感的细胞系，具有偶然性和困难性。针对现有问题，建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞系，从而筛选出敏感的细胞系。细胞系还是进行基因功能分析的理想材料，而对鱼类免疫基因功能的发掘意义重大。鱼类是特异性免疫系统和非特异性系统并存的脊椎动物，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)，属气单胞菌科，气单胞菌属，亦被称为舒氏气单胞菌。它是一种革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛分布于淡水、半咸水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，可致人的伤口感染，引起腹泻的重要致病菌。在水产养殖业尤其是鳢科鱼类养殖中，该菌引起的病害频繁发生，该菌可引起鱧科鱼类患结节病。据文献报道，该菌对鱼类细胞具有黏附作用。目前鱼类细胞的原代培养技术基本可以分为两种，组织块培养法和消化培养法。但是缺点均是容易产生机械损伤，细胞不易迁出。现在仍未见乌斑鳢脑来源细胞系的报道。可见目前需要研究一种乌斑鳢脑细胞系的构建方法，为后期建立乌斑鳢其他组织细胞系和进行病毒研究奠定扎实的基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种乌斑鳢脑细胞系(CAMB)。本专利技术的次要目的在于提供乌斑鳢脑细胞系的构建方法。本专利技术的再一目的在于提供乌斑鳢脑细胞系的应用。为达到上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018125。进一步的，该方法为：将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I消化，再加入胰酶消化，加入乌斑鳢脑细胞培养液培养，放入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得乌斑鳢脑细胞系。进一步的，包括以下步骤：1)将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I中进行消化，收集细胞，再加入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞；2)将上步收集到的细胞加入乌斑鳢脑细胞培养液制成细胞悬液，在26～28℃条件下进行原代培养；3)当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰酶液消化，消化后去酶液，加入乌斑鳢脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。进一步的，所述乌斑鳢脑组织先浸泡在三抗溶液中，所述三抗溶液为青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液。进一步的，乌斑鳢脑组织为剪碎的无菌的乌斑鳢脑组织。进一步的，所述胶原酶I0.1％w/v，消化10-15min；所述胰酶0.25％w/v。消化时间为10～15min。进一步的，所述乌斑鳢脑细胞培养液为为M199培养基；所述M199培养基还包括终浓度为100u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液和20﹪胎牛血清，pH为7.2～7.6。进一步的，步骤(3)胰酶液中含有0.25％w/v胰酶和0.02％w/vEDTA。上述乌斑鳢脑细胞系在培养鱼类病毒中的应用；所述病毒为鲤春病毒血症病毒、乌斑鳢弹状病毒、蛙虹彩病毒、基因I型草鱼呼肠孤病毒、罗非鱼湖病毒的至少一种。上述乌斑鳢脑细胞系在气单胞菌粘附性的应用；所述气单胞菌为鳢源舒伯特气单胞菌。近年来有关鱼类非特异性相关功能基因组的克隆及免疫调节机理的研究已成为热点,本专利技术通过细菌黏附细胞实验对病原与宿主之间进行非特异性免疫功能研究。本专利技术的有益效果是：本专利技术乌斑鳢脑细胞系首次在体外成功培养，采用胰酶和胶原酶共同消化分离脑组织细胞，培养7天时，明显出现延伸生长；15天后铺满培养皿，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态；细胞连续传代培养16个月已传至50代，仍然保持上皮细胞形态特点、生长特性；甚至连续培养100代仍保持较强的生长特性和增殖特性，可提供大量的乌斑鳢脑来源细胞。本专利技术细胞系特性稳定，目前传至100代，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本专利技术乌斑鳢脑细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可以直接应用于病原研究。附图说明图1为相差显微镜下的乌斑鳢脑细胞系的形态；A为原代细胞；B为20代乌斑鳢脑细胞；C为50代乌斑鳢脑细胞；D为80代乌斑鳢脑细胞；图2为悬浮CAMB的检测参数；注：细胞计数：12215个；平均体积：1.28pL；平均直径：13.5μm；图3为乌斑鳢脑细胞系的最适培养条件；A为培养基：B为血清浓度；C为温度；图4为乌斑鳢脑细胞染色体；其中A为乌斑鳢脑细胞染色体，Numberofcells为细胞数目、Numberofchromosome为染色体数目；图5.乌斑鳢肾细胞病毒敏感性；其中A.空白对照；B.TiLV；C.SVCV；D.HSHRV；E.FV3；F.GCRV；图6.CAMB细胞的病毒感染PCR电泳图；其中泳道1：感染TiLV-2017A的CAMB细胞；泳道3：感染SVCV的CAMB细胞(套式PCR产物)；泳道5：感染SVCV的CAMB细胞(普通PCR产物)；泳道7：感染HSHRV的CAMB细胞；泳道9：感染FV3的CAMB细胞；泳道11：感染基因I型GCRV的CAMB细胞；泳道2、4、6、8、10和12分别为各病毒感染组的空白对照(加PBS组)；图7为鳢源舒伯特气单胞菌JW-I菌株对乌斑鳢脑细胞的黏附性(1000×)；其中A.空白对照；B.鳢源舒伯特气单胞菌JW-I黏附细胞。具体实施方式一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。/n

【技术特征摘要】
1.一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018125。


2.权利要求1所述的乌斑鳢脑细胞系的构建方法，其特征在于，该方法为：将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I消化，再加入胰酶消化液消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得乌斑鳢脑细胞系。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I中进行消化，再加入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞；
2)将上步收集到的细胞加入乌斑鳢脑细胞培养液制成细胞悬液，在26～28℃条件下进行原代培养；
3)当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰酶消化，消化后去酶液，加入乌斑鳢脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。


4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述乌斑鳢脑组织先浸泡在三抗溶液中，所述三抗溶液为青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液。


5.根据权利要求2或3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王英英，曾伟伟，王庆，李莹莹，尹纪元，石存斌，常藕琴，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44