细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用制造技术

本发明专利技术提供细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用。本发明专利技术将细胞因子作为刺激剂，牙髓干细胞表面均表达本发明专利技术所选5种因子受体，5种细胞因子均能刺激牙髓干细胞增殖、分化或迁徙，细胞增殖、分化、迁徙等过程均是细胞活化及细胞代谢旺盛的过程，细胞在活化状态下可分泌大量的外泌体。因此，经5种细胞因子刺激后，牙髓干细胞处于活化状态，进而显著提高牙髓干细胞的外泌体分泌量，所得的外泌体可用于抗衰老或其他医疗用途，具有广阔的市场价值。

The application of cytokines in promoting the secretion of exosomes by dental pulp stem cells

【技术实现步骤摘要】
细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是一群具有成骨、成软骨和成脂肪功能的成体干细胞。MSC可以通过旁分泌的形式，发挥调节免疫、促进血管新生和支持造血等功能。MSC来源丰富，存在于胎盘、脐带、骨髓、牙髓、脂肪等多种组织中。因此，MSC作为药物已经被多个国家批准，用于移植物抗宿主病、溃疡型结肠炎、心肌梗塞恢复期等疾病的治疗。然而，无论静脉注射、肌肉注射或心肌内注射，外源移植的MSC多在72小时内死亡。那么，关于死亡的MSC如何发挥上述作用这一问题，既往的研究表明，体外培养的MSC在低氧和血清撤除条件下，可以释放大量的外泌体，这种外泌体在体外可以促进内皮细胞增殖，促进内皮细胞形成毛细血管网状结构，加速缺血模型血流的恢复。事实上，MSC来源的外泌体已经进入临床试验阶段，用于糖尿病和肾功能不全的治疗。因此，MSC来源的外泌体作为“无细胞”细胞治疗的材料，具有潜在的实用价值。为提高治疗效果，探索获取具有更强功能外泌体的途径，对开展MSC外泌体的临床试验研究是十分必要的。现有技术中却没有对干细胞外泌体分泌的促进因子进行过专门研究。申请公布号为CN106492194A的中国专利公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用，其采用的细胞因子仅仅为碱性成纤维细胞生长因子，其制备的制剂是作为外泌体的补充，是额外添加至外泌体中，该专利是将牙髓干细胞+外泌体+碱性成纤维细胞生长因子(10ng/ml)作为一种混合制剂治疗胃炎，没有对干细胞外泌体分泌的促进因子进行专门研究，也未涉及能够用于皮肤的干细胞培养。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂促进牙髓干细胞分泌外泌体。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂用于促进牙髓干细胞分泌外泌体。该外泌体具体可以用于制备抗皮肤衰老药物等用途。可选地，所述细胞因子选自表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素一号增长因子(IGF-1)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、干细胞生长因子(SCF)、γ-干扰素(IFN-γ)中的至少一种。优选地，所述细胞因子为表皮细胞生长因子(EGF)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的组合。优选地，所述表皮细胞生长因子与所述人血小板衍生生长因子BB的质量比为1：1。本专利技术还提供一种外泌体的制备方法，包括：将细胞因子加入培养基中，制得含有细胞因子的培养基，将牙髓干细胞加入所述培养基中培养，得到牙髓干细胞分泌的外泌体。可选地，所述细胞因子选自表皮细胞生长因子(EGF)、类胰岛素一号增长因子(IGF-1)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、干细胞生长因子(SCF)、γ-干扰素(IFN-γ)中的至少一种。优选地，所述细胞因子为表皮细胞生长因子(EGF)、人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的组合。优选地，所述表皮细胞生长因子与所述人血小板衍生生长因子BB的质量比为1：1。可选地，所述表皮细胞生长因子在所述培养基中的浓度为1-20ng/mL，优选为10-20ng/mL，包括但不限于1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL等。可选地，所述类胰岛素一号增长因子在所述培养基中的浓度为1-100ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL。可选地，所述人血小板衍生生长因子BB在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。可选地，所述干细胞生长因子在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。可选地，所述γ-干扰素在所述培养基中的浓度为1-50ng/mL，包括但不限于1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。可选地，所述培养基包括用于促进牙髓干细胞生长的培养基，所述用于促进牙髓干细胞生长的培养基具体可以为MSC无血清培养基，该培养基可以从市场上购买得到。可选地，所述培养基还含有生理盐水，用于培养外泌体。可选地，将所述牙髓干细胞加入所述培养基中，培养的时间为72h。可选地，培养结束后，收集上清液，离心，得到所述外泌体。本专利技术提供上述方法制得的外泌体。本专利技术还提供含有上述外泌体的制剂，所述制剂用于促进成纤维细胞增殖和/或促进血管新生，进而起到抗皮肤衰老的作用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术将细胞因子作为刺激剂，牙髓干细胞表面均表达本专利技术所选5种因子受体，5种细胞因子均能刺激牙髓干细胞增殖、分化、迁徙，细胞增殖、分化、迁徙等过程均是细胞活化及细胞代谢旺盛的过程，细胞在活化状态下可分泌大量的外泌体。因此，经5种细胞因子刺激后，牙髓干细胞处于活化状态，进而显著提高牙髓干细胞的外泌体分泌量，所得的外泌体可用于抗衰老或其他医疗用途，具有广阔的市场价值。附图说明图1显示为本专利技术实施例的人牙髓干细胞的细胞形态学照片(50×)。图2和图3显示为本专利技术实施例的人牙髓干细胞的流式细胞学分析结果图。图4显示为本专利技术实施例的外泌体的形态观察(透射电镜)图。图5显示为本专利技术实施例的外泌体Westernblot检测结果图。图6显示为本专利技术实施例不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对成纤维细胞增殖的影响情况图。图7显示为本专利技术实施例不同细胞因子刺激牙髓干细胞分泌的外泌体对血管内皮细胞形成毛细血管样结构的影响情况图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。本专利技术选择牙髓干细胞，具有如下优点：1)来源丰富。6-12岁的小孩自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓干细胞。2)副作用小。牙髓干细胞是一种间充质干细胞，具有间充质干细胞的通性，不仅免疫原性低，不需经过严格配对即可使用，不会引起强烈的排异反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂用于促进牙髓干细胞分泌外泌体。/n

【技术特征摘要】
1.细胞因子在制备刺激剂中的应用，所述刺激剂用于促进牙髓干细胞分泌外泌体。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞因子选自表皮细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子、人血小板衍生生长因子BB、干细胞生长因子、γ-干扰素中的至少一种。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细胞因子为表皮细胞生长因子、人血小板衍生生长因子BB的组合。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述表皮细胞生长因子与所述人血小板衍生生长因子BB的质量比为1：1。


5.一种外泌体的制备方法，包括：将细胞因子加入培养基中，制得含有所述细胞因子的培养基，将牙髓干细胞加入所述培养基中培养，得到所述牙髓干细胞分泌的外泌体。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述细胞因子选自表皮细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐忆琳，陈巧林，
申请(专利权)人：中科细胞科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44