液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法技术

本发明专利技术提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。本发明专利技术筛选出意蜂蜜王浆主蛋白2（MRJP2）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明专利技术提供的意蜂蜜中MRJP2的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中MRJP2。可用于辅助意蜂蜜真实性评价。此外该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

Quantitative analysis of Italian honey mrjp2 by liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法本专利技术涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。一些不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。王浆主蛋白2（majorroyaljellyprotein2，MRJP2），是蜂蜜中的主要蛋白质之一，是蜂蜜中含量比较丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP2的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP2含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。对于如何准确定量蜂蜜中MRJP2的含量，目前尚无相关报道。液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列中的特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略基础上，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。本专利技术的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：(1)提取缓冲液：0.01MPBS，pH7.4；(2)胰蛋白酶液20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；(3)特征肽段1、2的标准品。本专利技术提供的利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中MRJP2蛋白含量的方法，包括以下步骤：A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测；优选地，液相色谱条件如下：色谱柱：C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5%的B；0.5-1.0min，5-15%的B；1.0-6.5min，15-40%的B；6.5-7.0min，40-95%的B；7.0-8.5min，95%的B；8.5-8.6min，95-5%B，8.6-10.0min，5%的B；流速：0.3mL/min；进样量：5.0µL。优选地，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速（sheathgasflowrate）38L/min；辅助气的流速（auxgasflowrate）15L/min；电喷雾电压（sprayvoltage）3.2KV；离子导管的温度（capillarytemperature）275℃；S-lensRFlevel设为60；离子源温度（Heatertemperature）380℃；采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2：其中，FullMS的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：70000；AGCTarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：200-1500Da；Spectrumdata：Centroid；Inclusion：on；其中，dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：17500，AGCTarget：1e5；MaximumIT：50ms；Loopcount：2；Isolationwindow：2.0Da；NCE：15，25，35；Spectrumdata：Centroid；而ddsettings中，MinimumAGC：8.0e3；Apextrigger：2-6s；Excludeisotope：on；Dynamicexclus：4.0s；Ifidle：pickother。本专利技术成功筛选出意蜂定量特征肽段IVNDDFNFDDVNFR，其特异性通过Uniprot数据库进行了验证；并选择稳定的内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量MRJP2。优选地，所述稳定同位素内标肽段为：IVNDDFNFDDVNFR*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有865.39446质荷比；包含质荷比为1026.46125、1517.62597的子离子。所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z:母离子为m/z:870.39862，同时包含质荷比为1036.47473、1527.63977的子离子。前述的方法，步骤C得到的标准曲线为Y=0.007651X+0.01499，R2=0.9987，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；MRJP2蛋白的线性检测范围为10-1000ng/mL，最低检出限为10ng/mL。该方法采用UHPLC-QExactivePlus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中MRJP2特征肽段/IS肽段峰面积比，推算MRJP2含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于MRJP2的特征肽段的母离子在液质上的峰面积和稳定同位素标记的内标（IS）肽段的在液质上的峰面积。应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本专利技术保护范围。本专利技术采用UHPLC-QExactiveplus仪器对蜂蜜中的MRJP2定量，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：研究发现，意蜂MRJP2的含量相对恒定，本专利技术据此建立起一套蜂蜜真实性评价的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，其特征在于，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：/n特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；/n特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。/n

【技术特征摘要】
1.液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，其特征在于，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：
特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；
特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：
(1)提取缓冲液：0.01MPBS，pH7.4；
(2)胰蛋白酶液20ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；
(3)特征肽段1、2的标准品。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；
B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；
C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，周金慧，丛晓蕾，张金震，金钥，杨宇辉，黄京平，袁媛，赵文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11