一种多肽探针及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于光交联和纳米金属颗粒自组装技术的多肽探针，其上修饰了具有蛋白翻译后修饰的多肽，将亲和识别与富集捕获过程一体化，实现了对蛋白翻译后修饰结合蛋白或其复合物的便捷高效地识别和鉴定。本发明专利技术在纳米金属颗粒上引入光交联基团，不仅使得多肽和结合蛋白之间的弱作用力转化为光交联基团形成的强共价键作用，可承受较强烈的洗脱条件，可捕获较低丰度以及瞬态相互作用的蛋白；而且避免了光交联基团修饰对多肽骨架的影响，较好的保持了多肽骨架的原始结构和识别特性，大大降低了对相应结合蛋白结合特异性的影响。本发明专利技术还提供了所述多肽探针的制备方法，及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定、蛋白修饰间相互作用的鉴定、新的蛋白修饰结合蛋白的发现中的应用。

A peptide probe and its application in the identification of post-translational modified binding proteins

【技术实现步骤摘要】
一种多肽探针及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种基于光交联和纳米金属颗粒自组装技术的多肽探针，其制备方法及其在翻译后修饰的结合蛋白鉴定、蛋白修饰间相互作用的鉴定、新的蛋白修饰结合蛋白的发现中的应用。
技术介绍
蛋白质翻译后修饰，是指在mRNA被翻译成蛋白质后，对蛋白质上个别氨基酸残基进行共价修饰的过程。在真核动物细胞中目前已发现有400多种蛋白质翻译后修饰形式，其中最常见的有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。细胞内许多蛋白质的功能，是通过动态的蛋白质翻译后修饰来调控的(蛋白质翻译后修饰研究进展，胡笳等，《科学通报》2005年6月第50卷第11期，1061-1072页)。蛋白质的甲基化修饰是在甲基转移酶催化下，在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化。另外也有对天冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化形成甲酯的形式。赖氨酸残基可以发生单甲基化(Kme1)、二甲基化(Kme2)或三甲基化(Kme3)修饰，而精氨酸残基则可以发生单甲基化修饰(Rme1)、对称二甲基化修饰(Rme2s)或非对称二甲基化(Rme2a)修饰。组蛋白赖氨酸甲基化可以发生在H3-K4、H3-K9、H3-K27、H3-K36、H3-K79和H4-K20等上，还可发生于H1N端。H3-K9，H3-K27，H4-K20的甲基化与染色体的钝化过程有关，而H4-K9的甲基化可能与大范围的染色质水平的抑制有关。H3-K4，H3-K36，H3-K79位的甲基化与染色体转录激活过程有关，其中H3-K4的单甲基化修饰可以对抗H4-K9甲基化所导致的基因抑制。组蛋白精氨酸甲基化位点可以发生在H3-R2、H3-R4、H3-R17、H3-R26上。乙酰化也是细胞内蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。组蛋白等许多蛋白都可以发生乙酰化。组蛋白的乙酰化，是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)催化的，去乙酰化由组蛋白去乙酰酶(histonedeacetylases,HDs或者HDACs)催化的。泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控系统，降解过程中需要三种酶的参与：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3。由E2s和E3s介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转。泛素化也是组蛋白修饰的一种重要形式，组蛋白的H2A和H2B是泛素化多发位点。已经找到了组蛋白H2B泛素化酶，并且发现组蛋白H2B泛素化和组蛋白甲基化存在关联。磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的，至少有30％的蛋白被磷酸化修饰。磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser,Thr,Tyr残基。在磷酸化调节过程中，细胞的形态和功能都发生改变。可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程。蛋白质糖基化可以按照氨基酸和糖的连接方式分为四类：O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化以及GPI(glycophosphatidlyinositol)锚定连接。蛋白质脂基化为长脂肪链通过O或者S原子与蛋白质缀合得到蛋白缀合物的过程，通常是蛋白质分子中半胱氨酸残基的S键被棕榈酰基乙酰化。或者被法呢基烷基化。这两种脂肪链通常共同修饰同一个蛋白质分子，通过脂肪链与生物磷脂膜良好的相溶性，将蛋白质固定在细胞膜上。在体内,各种翻译后修饰过程不是孤立存在的，在很多细胞活动中，需要各种翻译后修饰的蛋白共同作用。对于同一个蛋白可以拥有一种以上的后修饰过程，各种翻译后修饰形式相互影响、相互协调。磷酸化与糖基化在很多方面都具有相似性。组蛋白同时可以被甲基化和乙酰化共同修饰，组蛋白上乙酰化和甲基化的主要作用位点是组蛋白H3和H4末端保守的赖氨酸残基。组蛋白乙酰化修饰贯穿整个细胞周期，而甲基化修饰多发生在G2期以及异染色质组装过程。以组蛋白翻译后修饰为例：真核生物中基因组DNA以染色质形式存在，核小体是构成染色质的基本单位。核小体及高级染色质结构的形成，一方面有效储存和保护了DNA序列所蕴含的遗传信息；另一方面作为基因组DNA的具体存在方式，染色质结构也成为各种需要接触DNA的细胞过程(如转录、复制、损伤修复等)的天然障碍，从而使染色质成为了一个重要的遗传信息表达调控平台。染色质凝聚、松弛结构的形成，以及开放、闭合等状态的转换提供了一种超越DNA序列本身的调控机制，即表观遗传调控。表观遗传调控机制涉及到组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA甲基化、非编码RNA及染色质重塑等几个方面。其中组蛋白翻译后修饰(尤其在N端尾部)有很多类型，包括精氨酸甲基化(me、me2)、赖氨酸甲基化(me、me2、me3)、乙酰化(ac)、丙酰化(pr)、丁酰化(bt)、巴豆酰化(cr)、甲酰化(fo)、泛素化(ub)、SUMO化、赖氨酸β-羟基丁酰化(3ohib)、2-羟基异丁酰化(hib)、琥珀酰化(Succ)、丙二酰化、戊二酰化，以及磷酸化(ph)，ADP核糖化和生物素化(bio)等。上述种种修饰可以发生在组蛋白不同变体和组蛋白不同位点上，并可以成组或成簇地分布于染色质不同区段，被认为构成一类超越基因序列的“组蛋白密码”，控制着细胞内遗传信息的组织层次，在基因表达以及细胞分化与发育调控中发挥着重要的作用，与肿瘤等重大疾病的发生发展密切联系。为了完成精密的表观遗传调控，围绕“组蛋白密码”，细胞进化出一系列修饰酶系统来完成特定组蛋白修饰的建立和消除。产生特定组蛋白修饰的酶称作“书写器”(writer)，如组蛋白乙酰化酶(HAT)，甲基化酶(HKMT)等；把功能相反并特异性去除特定组蛋白修饰的酶称作“擦除器”(eraser)或“去修饰酶”，如各种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，去甲基化酶(HKDM)等；同样地，细胞内还存在一大类被称作“阅读器”(reader)的蛋白或结构域，可以特异地识别各种不同类型的组蛋白修饰，把特定组蛋白修饰与特定生物学功能后果偶联起来。以上组蛋白修饰调控因子的协同作用控制着诸如转录激活、转录沉默、DNA复制和修复、有丝分裂等重要细胞生理学过程，是表观遗传调控的重要生化和物质基础。组蛋白修饰间的“修饰对话”(modificationcrosstalk)对于了解组蛋白修饰介导的表观遗传调控也有着重要的意义。组蛋白“阅读器”元件可以同“擦除器”或“书写器”的催化结构域共存，这奠定了“修饰对话”的生化基础。例如，组蛋白赖氨酸去甲基化酶PHF8和KIAA1718均含有一个PHD锌指和JmiC结构域。这两个蛋白的P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽探针，其特征在于，包括纳米金属颗粒、修饰在纳米金属颗粒表面的多肽、修饰在纳米金属颗粒表面的光交联基团；所述多肽的氨基酸残基未发生蛋白翻译后修饰，或者，所述多肽的一个或多个氨基酸残基上具有蛋白翻译后修饰，所述多肽的C端为半胱酸残基；所述多肽通过C端的半胱酸残基修饰到纳米金属颗粒表面；/n优选，所述多肽含有5-100个氨基酸残基；进一步优选含有7-50个氨基酸残基；更优选含有10-30个氨基酸残基；/n优选，所述蛋白翻译后修饰是对氨基酸残基进行的共价修饰，彼此独立地选自甲基化、甲酰化、乙酰化、泛素化、丙酰化、丁酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、丙二酰化、2-羟基丁酰化、3-羟基丁酰化、戊二酰化、磷酸化、糖基化、脂基化、SUMO化和/或生物素化；/n优选，纳米金属颗粒、纳米金属颗粒表面修饰的多肽和光交联基团的摩尔数比为1:(20-2000):(10-1000)，优选为1:(50～1000):(20～500)。/n

【技术特征摘要】
1.一种多肽探针，其特征在于，包括纳米金属颗粒、修饰在纳米金属颗粒表面的多肽、修饰在纳米金属颗粒表面的光交联基团；所述多肽的氨基酸残基未发生蛋白翻译后修饰，或者，所述多肽的一个或多个氨基酸残基上具有蛋白翻译后修饰，所述多肽的C端为半胱酸残基；所述多肽通过C端的半胱酸残基修饰到纳米金属颗粒表面；
优选，所述多肽含有5-100个氨基酸残基；进一步优选含有7-50个氨基酸残基；更优选含有10-30个氨基酸残基；
优选，所述蛋白翻译后修饰是对氨基酸残基进行的共价修饰，彼此独立地选自甲基化、甲酰化、乙酰化、泛素化、丙酰化、丁酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、丙二酰化、2-羟基丁酰化、3-羟基丁酰化、戊二酰化、磷酸化、糖基化、脂基化、SUMO化和/或生物素化；
优选，纳米金属颗粒、纳米金属颗粒表面修饰的多肽和光交联基团的摩尔数比为1:(20-2000):(10-1000)，优选为1:(50～1000):(20～500)。


2.如权利要求1所述的多肽探针，其特征在于，所述多肽含有一个或多个赖氨酸残基，所述赖氨酸残基中的一个或多个上具有蛋白翻译后修饰；
优选，所述赖氨酸残基上的蛋白翻译后修饰彼此独立地选自赖氨酸残基的单甲基化、二甲基化、三甲基化，乙酰化、丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、甲酰化、泛素化、SUMO化、β-羟基丁酰化、2-羟基异丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化和/或戊二酰化；
优选，所述多肽是组蛋白的氨基酸序列片段，包含可发生蛋白翻译后修饰的赖氨酸残基，以及该赖氨酸残基N端之前的2-50个氨基酸残基和该赖氨酸残基C端之后的2-50个氨基酸残基；优选，包含可发生蛋白翻译后修饰的赖氨酸残基，以及该赖氨酸残基N端之前的3-25个氨基酸残基和该赖氨酸残基C端之后的3-25个氨基酸残基；更优选，包含可发生蛋白翻译后修饰的赖氨酸残基，以及该赖氨酸残基N端之前的4-15个氨基酸残基和该赖氨酸残基C端之后的4-15个氨基酸残基；
优选，所述组蛋白上可发生蛋白翻译后修饰的赖氨酸残基选自：H3-K4、H3-K9、H3-K14、H3-K18、H3-K23、H3-K27、H3-K36、H3-K56、H3-K79、H4-K5、H4-K8、H4-K12、H4-K16、H4-K20、H4-K31、H4-K44、H4-K59、H4-K77、H4-K79、H4-K91、H2A-K5、H2A-K9、H2A-K13、H2A-K15、H2A-K63、H2A-K119、H2B-K5、H2B-K16、H2B-K17、H2B-K5、H2B-K34、H2B-K120、H1K26和/或H1N端的赖氨酸残基；
优选，所述多肽选自：ARTKQTARKSC，ARTKQTARKSTGGKAC，ARTK(me3)QTARKSC，ARTKQTARK(cr)STGGKAC，或ART(ph)K(me3)QTARKSC。


3.如权利要求1所述的多肽探针，其特征在于，所述多肽含有一个或多个精氨酸残基，所述精氨酸残基中的一个或多个上具有蛋白翻译后修饰；
优选，所述精氨酸残基上的蛋白翻译后修饰彼此独立地选自单甲基化修饰、对称二甲基化修饰和非对称二甲基化修饰。


4.如权利要求1-3任一项所述的多肽探针，其特征在于，所述纳米金属颗粒选自纳米金颗粒，纳米银颗粒，纳米铜颗粒，纳米铁颗粒，纳米镍颗粒和/或纳米铝颗粒；优选纳米金颗粒或/和纳米银颗粒；
优选，所述纳米金属颗粒的粒径为1-50nm，优选为1-20nm，更优选为1-10nm；
优选，所述光交联基团选自叠氮苯、二苯甲酮和/或双吖丙啶；
优选，所述光交联基团通过连接分子修饰到纳米金属颗粒表面，所述连接分子的一端与光交联基团共价连接，连接分子的另一端用巯基修饰，形成巯基-连接分子-光交联基团的共价化合物，通过所述巯基修饰到纳米金属颗粒表面；
优选，所述连接分子是聚乙二醇、聚乙烯和/或聚丙烯；优选为分子量为200～1000的聚乙二醇。


5.权利要求1-4任一项所述多肽探针的制备方法，其特征在于，将纳米金属颗粒、多肽和光交联基团在溶液中反应，使多肽和光交联基团修饰到纳米金属颗粒表面；
优选，加入溶液中的纳米金属颗粒：多肽：光交联基团的摩尔比为1:(50-5000):(25-2500)，优选为1:(100-1000):(50-500)；
优选，所述溶液是0.1-5％柠檬酸盐水溶液，更优选为0.5-1.5％柠檬酸盐水溶液；
优选，所述柠檬酸盐是柠檬酸的钠盐、柠檬酸的钾盐或柠檬酸的铵盐；
优选，所述溶液是1％的柠檬酸三钠水溶液。
优选，所述反应在10-40℃，优选20-30℃下进行；
优选，所述制备方法进一步包括多肽探针的后处理步骤，所述步骤包括洗涤多肽探针，用液体悬浮保存。


6.一种识别或鉴定蛋白翻译后修饰结合蛋白或其复合物的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的多肽探针，在0～8℃下，在适于多肽探针和结合蛋白或其复合物结合的溶液中，将多肽探针与结合蛋白或其复合物，或者可能含有所述结合蛋白或其复合物的蛋白质混合物接触，并孵育1～24小时，然后进行光照交联，并去除未交联的蛋白质；
优选，所述结合蛋白或其复合物是蛋白翻译后修饰的阅读器蛋白或其复合物，或蛋白翻译后修饰的去修饰酶蛋白或其复合物；
优选，所述多肽探针中的多肽为ARTK(me3)QTARKSC；所述结合蛋白或其复合物是带有结构域WD40、PWWP、PHD、Tudor和/或Choromo的蛋白，包括但不限于：WDR5、EED、PPWD1、WDR61、CHAF1B、WDR46、BRPF1、HDGF、PWWP2A、BRD1、PSIP1、ZMYND11、BPTF、ING1、CXXC1、ING...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锴，翟贵金，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津;12