本发明专利技术公开了“MAFG‑AS1/PCBP2/FPN1”调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。本发明专利技术研究证实，在膀胱癌细胞中，表达升高的MAFG‑AS1结合PCBP2后能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达，进而通过PCBP2的运输作用，将铁离子传递给细胞膜上的FPN1，促进铁转运出胞外，导致铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG‑AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物。因此，PCBP2可在制备治疗膀胱癌药物中作为靶位点，也是临床上预测膀胱癌癌患者的分子标志物。
Application of mafG / AS1 / pcbp2 / fpn1 regulatory axis as target site detection reagent
【技术实现步骤摘要】
MAFG/AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及“MAFG/AS1/PCBP2/FPN1”调控轴及PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
技术介绍
顺铂（DDP）是治疗膀胱癌的一线化疗药物，DDP主要作用于细胞DNA的嘌呤和嘧啶碱基，与DNA形成顺铂-DNA加合物，导致DNA损伤，抑制DNA的复制和转录进而杀伤肿瘤细胞。近年来，膀胱癌细胞对顺铂耐药性的产生严重影响了顺铂的疗效。目前多认为顺铂耐药的机制主要存在两方面：肿瘤细胞DNA被破坏减少基于顺铂于DNA结合减少；损伤的DNA被DNA修复系统修复及细胞死亡逃逸机制启动，使得已经遭到顺铂破坏的细胞依旧存活。目前多种方式（包括促进凋亡、调控自噬等）尝试增加膀胱癌对顺铂的敏感性，但相当一部分膀胱癌患者对顺铂仍然耐药，严重影响膀胱癌患者的愈合。因此探索逆转膀胱癌细胞对顺铂耐药的方法是提高疗效的关键。铁死亡是一种铁依赖性的，以细胞内活性氧堆积为特征的非细胞凋亡形式的细胞死亡。形态上发生铁死亡的细胞会出现比正常细胞小的线粒体，且线粒体膜皱缩，同时线粒体嵴减少、消失，外膜破碎。细胞外三价铁离子（Fe3+）与transferrin（TF）结合后形成TF-Fe3+，在膜蛋白transferrinreceptorprotein1（TFR1）的介导下进入细胞内，并被还原成Fe2+。在divlentmetaltransporter（DMT1）、ZRT/IRT-likeproteins8/14(ZIP8/14)的协助下存储到细胞内的labileironpool（LIP）中。另外，胞内Fe2+在PCBP2等铁伴侣蛋白的协助下经过膜蛋白运铁蛋白1(FPN1)泵出铁离子，维持胞内铁平衡。铁过载与细胞膜脂质过氧化有关,导致大量活性氧簇（ROS），促使细胞发生铁死亡。多项研究证实促进铁死亡能增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤性。因此深入研究铁死亡在膀胱癌顺铂耐药中的作用及分子机制，对膀胱癌的治疗具有重要意义。Longnon-codingRNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。LncRNAs能通过转录调控、组蛋白修饰、结合蛋白、ceRNA等机制参与多种生物学行为的调控。目前有少数文献报道LINC00336、P53RRA等lncRNAs参与肿瘤细胞铁死亡的调控。MAFBZIPTranscriptionFactorGAntisenseRNA1（MAFG-AS1）是最新被报道的能促进肿瘤增殖及转移的lncRNA，但MAFG-AS1在膀胱癌中的作用尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种可以用于制备膀胱癌顺铂增敏药物的新靶点。在本研究中，抑制MAFG-AS1表达能诱导铁死亡进而增加顺铂对膀胱癌细胞的杀伤力。在本研究中，我们首次发现在膀胱癌细胞中高表达的MAFG-AS1与PCBP2结合后能促进胞内铁离子的泵出，进而诱导铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG-AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物；并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。本专利技术首次证实MAFG-AS1在膀胱癌中也发挥癌基因作用，能促进膀胱癌细胞的增殖能力。本专利技术还首次揭示膀胱癌中表达升高的MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡，且细胞及动物层面均证实MAFG-AS1能通过抑制铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。本专利技术从铁离子水平改变角度探索的MAFG-AS1诱导膀胱癌铁死亡抵抗的新机制。通过ChIRP-MS高通量测序方法发现与MAFG-AS1探针结合差异表达的蛋白有26个，其中包括PCBP2等蛋白。我们通过PRM-MS法验证了MAFG-AS1与PCBP2蛋白直接结合，证实MAFG-AS1与PCBP2相结合。通过分析相关去泛素化酶在膀胱癌中的表达水平、预后及与PCBP2相关性，最终筛选出在膀胱癌中高表达或预后相关或与PCBP2表达呈正相关性的5个去泛素化酶UCHL5、USP5、COPS6、PSMD14、OTUB1。通过GSE83586、GSE87304、GSE13507、GSE31684等芯片分析发现在膀胱癌中UCHL5与PCBP2呈正相关；并WB及COIP方法检测证实MAFG-AS1通过招募去泛素化酶UCHL5从而上调PCBP2蛋白表达水平。蛋白结合预测发现PCBP2与FPN1相结合。WB及COIP方法检测证实PCBP2结合FPN1之后能够将携带的铁离子经由FPN1向胞外输出铁离子进而抑制铁死亡。总之，本专利技术首次发现在膀胱癌细胞中，表达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达，进而通过PCBP2的运输作用，将铁离子传递给细胞膜上的FPN1，促进铁转运出胞外，导致铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG-AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物；并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。靶向MAFG-AS1/PCBP2/FPN1途径可能成为改善膀胱癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。附图说明图1：MAFG-AS1抑制膀胱癌细胞铁死亡。A-B：MTT法检测MAFG-AS1敲除后T24/RT4细胞的增殖情况，联合应用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK，自噬抑制剂3-MA，铁死亡抑制剂DFO或铁死亡诱导剂Erastin。C，D，E，F：用相应的试剂盒检测Iron和Lipid-ROS水平。G，H：PCR检测干扰MAFG-AS1后T24/RT4细胞中MAFG-AS1的表达。I，G：克隆形成实验检测改变MAFG-AS1后的细胞增殖。K，L：检测改变MAFG-AS1后T24/RT4细胞MDA、Iron和Lipid-ROS水平。p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图2：MAFG-AS1通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性。A-D：MTT和克隆形成试验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在敲除MAFG-AS1和/或DFO处理后的细胞增殖。E-G：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。H-K：MTT和克隆形成实验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在过表达MAFG-AS1和/或Erastin后的细胞增殖。L-N：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。nsp>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图3：体内实验证实敲除MAFG-AS1可通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗的敏感性。A，G：在T24/RT4细胞中敲除MAFG-AS1和/或DDP处理后，用PCR检测MAFG-AS1的表达。B，H：处死后从指定小鼠分离的肿瘤组织。C，I：处死后指定小鼠的肿瘤体积。D，J：采用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达。E，F，K，L：测定动物血清中MDA和Iron的含量。nsp>0.05，*p＜0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用,其特征是，MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中。/n
【技术特征摘要】
1.MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用,其特征是，MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌是指BUC。
【专利技术属性】
技术研发人员：曹科，向亮，肖梦卿，何东，朱煜星，曾庆海，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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