一种马来酸异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型马来酸异构酶突变体，对应于如SEQ ID NO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L，A224G的突变。本发明专利技术发现新型马来酸异构酶以及其突变体相对于具有提高的酶活力和稳定性，突变体更为突出。此外，本发明专利技术还公开了马来酸异构酶或其突变体以任何形式与L‑天冬氨酸氨裂解酶组合应用于天冬氨酸的生产，包括二者耦合在一起的共表达的一菌双酶形式。

A mutant of maleate isomerase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种马来酸异构酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，更具体而言，本专利技术涉及一种马来酸异构酶及其应用。
技术介绍
L-天冬氨酸作为20种基本氨基酸的一种，广泛参与各种蛋白质合成中，是多种生物合成的前体。作为原料，L-天冬氨酸在食品、医药、化工等方面有广泛应用，下游产品包括丙氨酸、环保材料聚天冬氨酸、阿斯巴甜等。传统生产L-天冬氨酸的方法为苯化学法开环裂解，化学催化法生成富马酸，再由L-天冬氨酸生产菌株全菌催化生成L-天冬氨酸。此步骤涉及2步化学催化以及一步发酵全菌体催化，路线长且不经济环保。近年来，报道了由顺式丁烯二酸(马来酸)作为出发底物经过顺式丁烯二酸异构酶(马来酸异构酶，Maleatecis-transIsomerase，MaiA，EC5.2.1.1)催化异构化生成富马酸，再经过天冬氨酸氨裂解酶催化合成天冬氨酸的全生物绿色转化方法(参见CN106755157A、CN107475320A)。然而，虽然这些生物绿色合成L-天冬氨酸的工艺取得了巨大进步，但具有成本相对较高、异构酶活力较低、稳定性差等缺点。因此，作为采用新工艺的全生物法仍处于工业化推广困境中。要解决上述问题，最为关键的是提升异构酶表达活性以及稳定性、并进一步整合将生物酶法技术压缩至最低。目前有报道研究的异构酶有Serratiamarcessens、Rhodococcussp.RHA1、AlcaligenesfaecalisIFO13111、B.stearothermo.philusMI102等物种来源的马来酸异构酶。但是，这些异构酶仍存在酶活力较低、稳定性较差、在工业生产方面易受成本限制等缺陷。因此，本领域仍然存在对新型的马来酸异构酶及其使用方式的需要。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种新型的马来酸异构酶，其相对于目前已知的马来酸异构酶，具有提高的酶活力与稳定性，且在转化马来酸生产L-天冬氨酸时，具有更好的底物转化效果以及更为灵活、简单的使用方式。本专利技术提供以下技术方案。一方面，本专利技术提供一种马来酸异构酶突变体，对应于如SEQIDNO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L和/或A224G的突变。SEQIDNO.1示出了NCBI序列ID：WP_010929891.1的马来酸异构酶的氨基酸序列。按照该大类的马来酸异构酶的三维结构特点以及采用酶工程随机突变技术，在一个或多个位点进行突变后得到一系列突变体，再经过稳定性、酶活性等筛选，得到本专利技术提供的马来酸异构酶突变体。具体地，相对于该已知马来酸异构酶(亲本)，本专利技术提供的马来酸异构酶突变体为两点突变酶(F39L，A224G)的突变。优选地，本专利技术的马来酸异构酶突变体包含如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；更优选地，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。另一方面，本专利技术提供编码所述马来酸异构酶突变体的基因序列；优选地，所述基因序列包含如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；更优选地，所述基因序列包含如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。还一方面，本专利技术提供包含所述基因序列的载体；优选地，所述载体为重组载体，优选为重组表达载体，更优选为用于在细菌、例如大肠杆菌(E.coli)中表达的重组表达载体。根据本专利技术的具体实施方式，所述载体为pET29a-Bptm。又一方面，本专利技术提供包含所述载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为用于从所述载体表达所述马来酸异构酶突变体的宿主细胞，优选为细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞。实验表明，在将底物马来酸转化为富马酸的转化方面，本专利技术提供的马来酸异构酶突变体相对于亲本酶或其他菌株来源的马来酸异构酶具有显著提高的酶活力与稳定性，具有催化马来酸异构化生成富马酸的用途。因此，再一方面，本专利技术提供所述马来酸异构酶突变体、所述基因序列、所述载体或者所述宿主细胞在催化马来酸异构化生成富马酸中的应用。在所述应用中，所述马来酸异构酶突变体或由所述基因序列、所述载体或者所述宿主细胞得到的马来酸异构酶突变体可以是酶的游离形式或固定化形式。上述转化得到的富马酸可以同时或进一步地在天冬氨酸氨裂解酶的作用下转化成天冬氨酸。因此，本专利技术提供所述马来酸异构酶突变体、所述基因序列、所述载体或者所述宿主细胞在以马来酸为底物生产L-天冬氨酸中的应用。在所述应用中，所述马来酸异构酶突变体或由所述基因序列、所述载体或者所述宿主细胞得到的马来酸异构酶突变体可以是酶的游离形式或固定化形式。本专利技术进一步提供以下技术方案。一方面，本专利技术提供一种基因构建体(例如核苷酸序列)，所述基因构建体包含编码L-天冬氨酸氨裂解酶的基因序列和编码马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的基因序列；优选地，所述基因构建体还包含用于表达L-天冬氨酸氨裂解酶和马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的元件，例如核糖体结合序列。根据本专利技术的具体实施方式，所述L-天冬氨酸氨裂解酶的氨基酸序列如NCBI序列ID：WP_086258271.1所示。所述马来酸异构酶包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；优选地，所述马来酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；或者，所述马来酸异构酶突变体包含如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；优选地，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。另一方面，本专利技术提供一种载体，其包含编码L-天冬氨酸氨裂解酶的基因序列和编码马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的基因序列。优选地，所述载体包含本专利技术提供的所述基因构建体；优选地，所述载体为重组载体，优选为重组表达载体，更优选为用于在细菌、例如大肠杆菌(E.coli)中表达的重组表达载体。根据本专利技术的具体实施方式，所述载体为pET29a-Bptm-EAsp。又一方面，本专利技术提供包含所述载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为用于从所述载体表达所述L-天冬氨酸氨裂解酶和所述马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的宿主细胞，优选为细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞。实验表明，本专利技术的基因构建体在合适体系中，共同表达马来酸异构酶或其突变体与L-天冬氨酸氨裂解酶，并且在该异构酶或其突变体达到转化酶活要求时，L-天冬氨酸合成酶的酶活也可以达到转化相同底物的同等需求，因此具有在以马来酸为底物生产L-天冬氨酸中的用途。因此，还一方面，本专利技术提供所述基因构建体、所述载体或者所述宿主细胞在以马来酸为底物生产L-天冬氨酸中的应用。在所述应用中，由所述基因构建体、所述载体或者所述宿主细胞得到的马来酸异构酶或其突变体与L-天冬氨酸合成酶可以是酶的游离形式或固定化形式。本专利技术进一步提供以下技术方案。一方面，本专利技术提供一种以马来酸为底物生产L-天冬氨酸的方法，所述方法包括，以马来酸为底物，采用本专利技术提供的所述马来酸异构酶突变体、所述基因序列、所述载体或者本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马来酸异构酶突变体，对应于如SEQ ID NO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L和/或A224G的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种马来酸异构酶突变体，对应于如SEQIDNO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L和/或A224G的突变。


2.根据权利要求1所述的马来酸异构酶突变体，其特征在于，所述马来酸异构酶突变体包含如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；
优选地，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.编码权利要求1或2所述的马来酸异构酶突变体的基因序列；
优选地，所述基因序列包含如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；
更优选地，所述基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.包含权利要求3所述的基因序列的载体；
优选地，所述载体为重组载体，优选为重组表达载体，更优选为用于在细菌中表达的重组表达载体。


5.包含权利要求4所述的载体的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞为用于从所述载体表达所述马来酸异构酶突变体的宿主细胞，优选为细菌细胞。


6.权利要求1或2所述的马来酸异构酶突变体、权利要求3所述的基因序列、权利要求4所述的载体或者权利要求5所述的宿主细胞在催化马来酸异构化生成富马酸中的应用。


7.权利要求1或2所述的马来酸异构酶突变体、权利要求3所述的基因序列、权利要求4所述的载体或者权利要求5所述的宿主细胞在以马来酸为底物生产L-天冬氨酸中的应用。


8.一种基因构建体，所述基因构建体包含编码L-天冬氨酸氨裂解酶的基因序列和编码马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的基因序列；
优选地，所述基因构建体还包含用于表达L-天冬氨酸氨裂解酶和马来酸异构酶或马来酸异构酶突变体的元件。


9.根据权利要求8所述的基因构建体，其特征在于，所述马来酸异构酶包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；优选地，所述马来酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；或者
所述马来酸异构酶突变体包含如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；优选地，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：任丽梅，李鹤，朱科，李红飞，楚伟冬，王艳艳，袁国强，
申请(专利权)人：石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司，石药集团中奇制药技术石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13