多肽、嵌合聚合酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多肽、嵌合聚合酶及其应用。该多肽具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。该嵌合聚合酶包括：噬菌体DNA聚合酶；上述多肽；连接噬菌体DNA聚合酶和上述多肽的连接肽。野生型的DNA聚合酶对高浓度盐的耐受性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，无法得到预期的延生产物，而本发明专利技术所提供的多肽可以有效提高DNA聚合酶的耐盐性，在通过连接肽将其连接到DNA聚合酶上形成嵌合DNA聚合酶后，聚合酶的耐盐性有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。

Polypeptide, chimeric polymerase and its application

【技术实现步骤摘要】
多肽、嵌合聚合酶及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种多肽、嵌合聚合酶及其应用。
技术介绍
目前，在医学、生物学、农学以及相关的一些领域，核酸扩增正成为一种普遍的检验中间手段。而在核酸扩增的诸多方法中，聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是用于体外DNA扩增的最常用方法。在PCR过程中，通常利用寡核苷酸引物、DNA聚合酶以及特定的模板链等通过退火延伸来生成DNA双链产物，并借由提高和降低反应混合物的温度(即，热循环)使得DNA双链产物的两条链重新分开，充当下一轮退火和延伸的模板并不断重复从而实现扩增。在过去的十几年间，已经开发出了不依赖于热循环的其它核酸扩增方法。这些方法因其循环过程无需依赖运行温度的变化而被称为是“等温扩增”。等温扩增作为PCR的有益补充，主要应用在微量的全基因组扩增和检测等方面。大多数的等温扩增过程中需要用到具有较强的链置换活性的DNA聚合酶，这些酶可以在复制的时候置换下游的DNA链从而不需要模板变性。Phi29DNA聚合酶是等温扩增过程中的一种常用聚合酶，该聚合酶主要从枯草芽孢杆菌噬菌体Phi29中分离得到，具有良好的链置换能力和持续合成能力，目前已成为等温扩增的首选DNA聚合酶。但也应该看到，野生型Phi29DNA聚合酶的两个缺陷：(1)耐盐性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，难于适应在高盐体系中的应用；(2)底物DNA结合能力较差，需要提高反应体系中的酶量，来提高扩增产物。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种能够提高DNA聚合酶耐盐性的多肽、包含该多肽的嵌合聚合酶以及该嵌合聚合酶的应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一方面，提供一种多肽，该多肽具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。本专利技术实施例的有益效果是：该多肽可以有效提高DNA聚合酶的耐盐性，在通过连接肽将其连接到DNA聚合酶上形成嵌合DNA聚合酶后，聚合酶的耐盐性有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。本专利技术的第二方面，提供一种嵌合聚合酶，包括：噬菌体DNA聚合酶；上述多肽；连接噬菌体DNA聚合酶和上述多肽的连接肽。其中，上述多肽为超嗜热甲烷菌(Methanopyruskandleri)拓扑异构酶V羧基端的E-LHhH模序，E-LHhH模序具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列，或具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；该嵌合聚合酶相比于现有的野生型的DNA聚合酶而言，耐盐性能有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。根据本专利技术的一些实施例，噬菌体DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。根据本专利技术的一些实施例，Phi29DNA聚合酶具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。根据本专利技术的一些实施例，噬菌体DNA聚合酶通过羧基端与所述连接肽相连。根据本专利技术的一些实施例，连接肽是至少2个氨基酸长的氨基酸序列，其使得嵌合聚合酶能够保持其两端功能性氨基酸序列的结构和功能。具体的连接肽序列的选择可以采用常用的柔性连接肽、刚性连接肽；或结合生物信息学技术，根据同源建模的方法计算机辅助相应的遗传算法设计相应的连接肽。根据本专利技术的一些实施例，连接肽具有如SEQIDNo.5或SEQIDNo.9所示的氨基酸序列或具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。本专利技术的第三方面，提供编码上述嵌合聚合酶的核苷酸序列。根据本专利技术的实施例，该核苷酸序列可以是如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列。本专利技术的第四方面，提供一种重组载体，该重组载体包括上述的核苷酸序列。根据本专利技术的实施例，该重组载体可以是在质粒载体的多克隆位点插入上述核苷酸序列得到的重组质粒。根据本专利技术的实施例，质粒载体可以是诸如pET28a等本领域所知的质粒载体。根据本专利技术的实施例，重组载体可以是在诸如pET28a等质粒载体的EcoRⅠ和NotⅠ酶切识别位点插入上述核苷酸序列得到的重组质粒。本专利技术的第五方面，提供一种重组细胞，该重组细胞包括上述的核苷酸序列。根据本专利技术的实施例，该重组细胞可以是将上述重组载体导入大肠杆菌得到的重组细胞。根据本专利技术的实施例，该重组细胞可以是将上述重组载体导入大肠杆菌DH5α得到的重组细胞。本专利技术的第六方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述的嵌合聚合酶。根据本专利技术的实施例，该试剂盒可以是DNA扩增试剂盒或测序试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包括上述的嵌合聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、引物。本专利技术的第七方面，提供一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，包括将模板DNA与混合物接触的步骤，混合物包括缓冲液、引物、核苷三磷酸和上述任一种嵌合聚合酶。根据本专利技术的实施例，提供一种滚环扩增的方法，包括将模板DNA与上述嵌合聚合酶、缓冲液、引物、核苷三磷酸混合，在特定温度条件下作用一定时长。根据本专利技术的实施例，提供一种滚环扩增的方法，包括将模板DNA与上述嵌合聚合酶、缓冲液、引物、核苷三磷酸混合，在20-30℃的温度条件下反应30min-3h。附图说明图1是本专利技术的一个实施例的突变型Phi29-el嵌合聚合酶的构建策略图。图2是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的PCR产物和回收产物结果，其中A是PCR结果，B是回收产物结果，A和B中marker右侧分别代表Phi29的质粒模板的条带和TopV-el的质粒模板的条带。图3是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的酶切产物和酶切回收产物的结果。其中，A表示酶切产物的电泳结果，泳道2和泳道3为Phi29片段、泳道4和泳道5为TopV-el片段；B表示酶切回收产物的电泳结果，泳道2为Phi29片段、泳道3为TopV-el片段。图4是野生型Phi29DNA聚合酶和突变型Phi29-el嵌合聚合酶的12％SdS-PAGE电泳结果，A表示野生型Phi29DNA聚合酶的电泳结果，B表示突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果。图5是野生型Phi29DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的扩增能力检测结果。A是野生型Phi29DNA聚合酶的电泳检测结果，B是突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳检测结果，A和B中的泳道2、泳道3、泳道4、泳道5分别代表酶和模板的浓度比例为20、10、5和2.5倍的情况。图6是野生型Phi29DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的耐盐性能力检测结果，其中，A为野生型Phi29DNA聚合酶的电泳结果，B为突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果，A和B中的泳道3-5分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的NaCl，泳道6-8分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的KCl；C和D分别表示A和B中的野生型Phi29DNA聚合酶及突变型Ph本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。


2.一种嵌合聚合酶，其特征在于，包括：
噬菌体DNA聚合酶；
权利要求1所述的多肽；
连接肽，用于连接所述噬菌体DNA聚合酶和权利要求1所述的多肽。


3.根据权利要求2所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述噬菌体DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶。


4.根据权利要求3所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述Phi29DNA聚合酶具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。


5.根据权利要求2所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述连接肽具有如SEQIDNo....

【专利技术属性】
技术研发人员：高亚平，田晖，何筠，伊戈尔·伊万诺夫，
申请(专利权)人：深圳清华大学研究院，安序源生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44