一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，通过定点突变技术将腾冲嗜热厌氧菌中丙氨酸消旋酶的173、360两个位点分别突变，构建双点突变表达载体pET‑S173Q/Q360Y，通过原核表达、纯化获得酶蛋白。所获得的突变体蛋白对底物L‑Ala的表观二级速率常数

A mutant protein of alanine racemase and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法
本专利技术涉及一种原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程

技术介绍
丙氨酸消旋酶（Alanineracemase,Alr,EC5.1.1.1）是一种以磷酸吡哆醛（Pyridoxal5′-phosphate,PLP）为辅酶，具有催化L-丙氨酸和D-丙氨酸之间相互转化的功能，归类于异构酶家族。反应如下所示：L-alanine⇄D-alanine丙氨酸消旋酶主要来自原核生物，其催化反应产物D-丙氨酸是非天然氨基酸中的一类，D-丙氨酸不仅是细菌细胞壁肽聚糖层四肽尾的重要组成成分之一，在药物合成、食品、饲料和化妆品等行业也有着非常广泛的应用前景。目前合成D-丙氨酸的方法主要有化学合成法、微生物发酵法和生物酶法三种，这三种方法各有其优缺点：化学合成法反应机制复杂、工艺过程长且生产成本较高；微生物法周期长、设备成本高，产物含量低，分离纯化困难；生物酶法有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但存在着酶蛋白稳定性差、活性低、生产成本高等不足。因此，开发一种高效的D-丙氨酸合成途径一直是广大科研工作者的关注点之一。日本京都大学KenjiSoda教授曾提出利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶四酶偶联合成D-氨基酸（Galkinetal.,1997）的思路，该方法实现了辅酶NADH的循环再生，降低了合成D-氨基酸的生产成本。然而，由于丙氨酸消旋酶催化反应为可逆平衡反应，其平衡常数Keq(L/D）接近1.0，这决定了其反应产物D-丙氨酸的理论转化率不超过50%，使得反应液中D、L-丙氨酸并存（反应平衡状态下，二者比率接近1：1），增加了后续分离纯化获得D-丙氨酸的工艺复杂性。因此，开发获得具有高催化活性、稳定性好和转化效率高的丙氨酸消旋酶对于生物合成D-丙氨酸具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶活力高、稳定性好和转化效率提高的原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白。本专利技术的目的还在于提供一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的。本专利技术提供的一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。其中：（1）SEQIDNo.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；（2）SEQIDNo.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。本专利技术还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供含有上述基因的表达载体及宿主细胞。本专利技术还提供含有上述基因的工程菌。本专利技术还提供上述突变体酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：（1）根据NCBI数据库中公开的来自腾冲嗜热厌氧菌的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列，通过与同源蛋白的序列比对确定突变位点，设计定点突变的突变引物对；所述的173位突变引物为：S173Q-F01：5′-TGCTGCCGCACAGGAAGATGAT-3′；S173Q-R01：5′-ATCATCTTCCTGTGCGGCAGCA-3′；所述的360位突变引物为：Q360Y-F01：5′-AACTATTCCTTATGAAGTTTTTTCT-3′；Q360Y-R01：5′-AGAAAAAACTTCATAAGGAATAGTT-3′；（2）以携带丙氨酸消旋酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物依次进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制内切酶DpnI酶切处理后转入大肠杆菌E.coli中，筛选获得突变质粒；（3）将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达获得突变体酶蛋白。所述制备方法的优选条件：步骤（2）中所述表达载体为pET系列中的任意一种；步骤（3）中所述工程菌为BL21(DE3)。本专利技术进一步提供上述突变体酶蛋白的应用，具体是将突变体酶蛋白用于转化产生D-丙氨酸。具体地，本专利技术是从腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobactertengcongensis）中获得丙氨酸消旋酶基因（alrTt，GenBankID.AAM24437.1），在与同源蛋白序列比对的基础上确定突变位点，基于定点突变技术（Site-directedMutagenesis）依此取代原有氨基酸位点，构建突变质粒pET-S173Q/Q360Y；该质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于突变体酶蛋白表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET-S173Q/Q360Y，在37℃、180rpm和1mMIPTG条件下获得了较好的表达。以表观二级速率常数kcat/Km和反应平衡常数Keq(L/D)表示，突变体蛋白S173Q/Q360Y的催化效率和反应平衡常数分别是野生型蛋白TtAlr的68.30倍和3.69倍。突变体的表观二级速率常数和反应平衡常数提高的倍数：腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶的突变体核苷酸序列为：SEQIDNO:2，氨基酸序列为：SEQIDNO:1。本专利技术取得的有益效果如下：本专利技术基于氨基酸序列同源比对结果确定突变位点，通过定点突变技术（Site-directedMutagenesis）构建获得丙氨酸消旋酶突变体蛋白S173Q/Q360Y，以表观二级速率常数kcat/Km和反应平衡常数Keq(L/D)表示，突变体蛋白的活性和转化率都有明显提高。附图说明图1为PCR扩增产物的电泳图谱。图1中M：DNAmarker；1：基因alrTt的PCR产物。图2为质粒pMD-TtAlr及pET-22b(+)双酶切电泳检测图。图2中1&2：经双酶切处理的质粒pMD-TtAlr；M：DNAmarker；3：经双酶切处理的质粒pET-28a。图3为定点突变PCR产物及pET-TtAlr双酶切电泳检测图。图3A中M：DNAmarker；1：173位点突变PCR产物；2：173/360双点突变PCR产物。图3B中M：DNAmarker；3：经双酶切处理的质粒pET-S173Q；4：经双酶切处理的质粒pET-S173Q/Q360Y。图4为纯化蛋白的SDS-PAGE图。图4中M：Proteinmarker；1：野生型蛋白TtAlr；2：突变蛋白S173Q/Q360Y。图5为突变体蛋白S173Q/Q360Y与TtAlr的热稳定性比较图。图5中□—□：野生型蛋白TtAlr；△—△：突变体蛋白S173Q/Q360Y。图6为突变蛋白S173Q/Q360Y与TtAlr的转化效率比较图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1克本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中：/nSEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；/n（B）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。/n

【技术特征摘要】
1.一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其中：
SEQIDNo.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；
（B）SEQIDNo.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。


2.一种编码如权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.一种制备如权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）根据NCBI数据库中公开的来自腾冲嗜热厌氧菌中的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列，在与同源蛋白的氨基酸序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变所需的引物；
所述的173位的突变引物为：
S173Q-F01：5′-TGCTGCCGCACAGGAAGATGAT-3′；
S173Q-R01：5′-ATCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠建松，韩卿卿，徐书景，任晓朴，窦金萍，郭博涵，何广正，赵宝华，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：河北;13