一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备D-阿洛酮糖的方法技术

提供了一种新的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶以及使用该酶制备阿洛酮糖的方法。

A novel d-alloketose 3-epiisomerase and its preparation

A new d \u2011 alloketose 3 \u2011 epiisomerase and a method for the preparation of alloketose using the enzyme are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备D-阿洛酮糖的方法
以下公开涉及D-阿洛酮糖3-差向异构酶和使用其制备D-阿洛酮糖的方法。
技术介绍
D-阿洛酮糖(下文中称为"阿洛酮糖")是一种单糖，已知其是自然界中以非常小的量存在的稀有糖。其热量几乎为零，同时具有将近70％的糖甜度，并且由于其功能如抑制血糖和抑制脂质合成等，作为新的食品成分已经受到了广泛关注。由于这些特性，阿洛酮糖被考虑在各种食品中用作甜味剂代替糖。然而，由于阿洛酮糖在自然界以非常小的量存在，对有效制备阿洛酮糖的方法的需求日益增加。一种已知的制备阿洛酮糖的方法包括利用钼酸根离子催化的方法(Bilik,V.,Tihlarik,K.,1973,ReactionofSaccharidesCatalyzedbyMolybdateIons.IX.EpimerizationofKetohexoses.Chem.Zvesti.28:106–109)，一种通过将乙醇和三乙胺一起加热而由D-果糖制备阿洛酮糖的化学方法(Doner,L.W.,1979,IsomerizationofD-FructosebyBase:Liquid-ChromatographicEvaluationandTheIsolationofD-Psicose.Carbohydr.Res.70:209–216)，和一种使用产生D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物由D-果糖制备阿洛酮糖的生物学方法(韩国专利公开号10-2011-0035805)。通过化学方法制备阿洛酮糖的问题在于，产生大量的副产物，因此，需要进行复杂的纯化。此外，生物方法还存在产率非常低和制备成本高的问题。在这些情况下，本专利技术人付出了大量努力来开发一种提高阿洛酮糖的制备产量的方法，并且结果证实，当使用本专利技术的新的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(下文中称为"阿洛酮糖差向异构酶")时，D-果糖转化为阿洛酮糖的速率(下文中称为从D-果糖转化为阿洛酮糖的转化速率)增加，从而能够显著地提高阿洛酮糖的制备产量，并且完成了本专利技术。技术问题本专利技术的一个实施方案涉及提供一种新的阿洛酮糖差向异构酶、编码该阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体以及其中导入该载体的微生物。本专利技术的另一个实施方案涉及提供一种用于制备D-阿洛酮糖的组合物，其包括阿洛酮糖差向异构酶、表达该阿洛酮糖差向异构酶的微生物或该微生物的培养物，以及一种使用该阿洛酮糖差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法。技术方案根据本专利技术的一个示例性实施方案，提供了一种由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。在一个示例性实施方案中，该阿洛酮糖差向异构酶可包括与SEQIDNO:1具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多肽。显然，具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性和上述同源性的氨基酸序列可以包括这样的情况，其中SEQIDNO:1的部分氨基酸序列被取代、插入、修饰和/或删除。此外，具有阿洛酮糖差向异构酶活性的多肽也可以包括而不限于由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与编码探针的核苷酸序列的全部或部分的互补序列在严格条件下杂交，所述探针能够从已知基因序列制备，例如本专利技术的阿洛酮糖差向异构酶。本文所用的术语"多核苷酸"指多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其中核苷酸单体未经修饰或经修饰，通过共价键形成以长链延伸的核苷酸聚合物。本文所用的术语"严格条件"指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。所述条件取决于多核苷酸的长度和互补程度。其参数是本领域公知的，并在文献中具体描述(例如，J.Sambrook等，同上)。例如，严格条件可以列举彼此具有80％、90％、95％、97％或99％或更高的高同源性的基因彼此杂交的条件，彼此具有低于其的同源性的基因彼此不杂交的条件，或Southern杂交的一般洗涤条件，即在盐浓度和温度，如60℃、1×SSC、0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更特别是68℃、0.1×SSC、0.1％SDS洗涤一次，特别是洗涤两次到三次的条件。杂交中使用的探针可以是碱基序列的互补序列的一部分。这样的探针可以以含有碱基序列的基因片段为模板，以根据已知序列制备的寡核苷酸为引物，通过PCR来构建。此外，本领域技术人员可以根据需要诸如探针长度的因素，调节洗涤溶液的温度和盐浓度。本文所用的术语"同源性"指两个多核苷酸或多肽部分之间的相同性百分比。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过已知技术确定。例如，同源性可以通过直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息的参数来确定，例如得分、相同性和相似性等，使用对序列信息分类且容易获得的计算机程序(例如BLAST2.0)进行。此外，多核苷酸之间的同源性可以通过在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，然后通过单链特异性核酸酶降解以确定降解片段的大小来确定。此外，只要蛋白质具有相应于由在本专利技术的SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶的活性，可以在SEQIDNO:1的氨基酸序列之前和之后添加无义序列，或包括天然存在的突变或其沉默突变。包括SEQIDNO:1的蛋白质也包括在本专利技术的范围内。另外，本专利技术的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可由SEQIDNO:2的多核苷酸序列，或与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多核苷酸序列编码，但本专利技术不限于此。此外，明显的是，对于编码本专利技术的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的多核苷酸，通过密码子简并性，能够翻译成由SEQIDNO:1氨基酸序列组成的蛋白质或与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸也可包括在本专利技术的多核苷酸序列范围内。本领域技术人员会理解，使用已知的重组技术，通过取代、添加和/或缺失SEQIDNO:2的核苷酸序列的一或多个可以制备编码具有基本相等活性的酶的多核苷酸。在另一个示例性实施方案中，本专利技术的阿洛酮糖差向异构酶可衍生自Kaistia属的微生物。具体地，本专利技术的阿洛酮糖差向异构酶可衍生自Kaistiagranuli，更具体而言，可衍生自KaistiagranuliKCTC12575。在另一个示例性实施方案中，本专利技术的阿洛酮糖差向异构酶可具有通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量的25kDa至37kDa、27kDa至35kDa或30kDa至35kDa的分子量。根据本专利技术的另一个示例性实施方案，提供编码由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的多核苷酸。在一个示例性实施方案中，本文提供的多核苷酸可以是由SEQIDNO:2的碱基序列或与SEQIDNO:2具有80％、90％、95％、97％或99％或更高的同源性的序列组成的多核苷酸。此外，明显的是，对于本专利技术提供的多核苷酸，通过密码子简并性，能够翻译成由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的蛋白质或与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸也包括在本专利技术的范围内。根据本专利技术的另一个示例性实施方案，提供了一种重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161116 KR 10-2016-01529471.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。


2.权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其中该D-阿洛酮糖3-差向异构酶由SEQIDNO:2的多核苷酸序列编码。


3.一种编码权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸。


4.一种重组载体，其包含权利要求3的多核苷酸。


5.一种微生物，其中导入了权利要求4的重组载体。


6.一种用于制备D-阿洛酮糖的组合物，其包含：权利要求1的D-阿洛酮糖3-差...

【专利技术属性】
技术研发人员：金薮珍，李英美，金良姬，金成俌，朴承源，赵成捘，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR