水稻基因OsTPI1-1在水稻抗病性改良中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻基因OsTPI1‑1在水稻抗病性改良中的应用。OsTPI1‑1基因编码一个细胞质磷酸丙糖异构酶,该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示。OsTPI1‑1表达量显著上升使转化的水稻植株对白叶枯病的抗性增强。在主效抗病基因Xa3/Xa26的背景下OsTPI1‑1表达量显著下降使转化的水稻植株丧失对白叶枯病的抗性。功能验证表明，OsTPI1‑1基因是水稻抗白叶枯病反应中的正调控因子，可以通过超量表达OsTPI1‑1基因以改良水稻的抗病性。

Application of rice gene ostpi1-1 in rice disease resistance improvement

【技术实现步骤摘要】
水稻基因OsTPI1-1在水稻抗病性改良中的应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及一个水稻抗病相关基因OsTPI1-1的功能验证及应用。该基因编码一个定位于细胞质的磷酸丙糖异构酶，它正向调控水稻对白叶枯病以及抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26的抗性。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上一半以上的人口提供主食(Zhang，2007)。水稻的病害是限制水稻生产的重要因素，病害的盛行常导致水稻产量和品质的下降。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌的水稻致病变种-白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)引起的维管束病害，是世界上对水稻危害最严重的细菌性病害之一。根据植物对病原菌侵染的响应速度和强度，水稻对病原菌的抗性主要分为两个方面，分别为质量抗性(或称完全抗性)和数量抗性(或称部分抗性)。质量抗性可以由单个主效抗病(majordiseaseresistance，MR)基因介导，对于病原菌的抗性一般是小种特异性的，具有抗性水平高和速度快的特点。数量抗性一般为多基因或数量性状位点介导，通常具有广谱性和持久性，但是抗性水平一般较低(Kou和Wang，2010；Zhang和Wang，2013)。其中由MR基因介导的质量抗性是水稻抗病育种中已被广泛运用的主要抗性资源。到目前为止，水稻中已被克隆的抗白叶枯病主效基因有11个，包括Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa27和xa41(Hu等，2017；张海涛和王石平，2016)。其中Xa3/Xa26是一个已经在我国的水稻生产中运用多年的抗病基因，可以介导对多种白叶枯病菌致病小种的高效持久抗性(Gao等，2010)。虽然MR基因介导的抗病反应强，但由于多种原因，使MR基因在植物抗性改良中的利用受到一定限制：(1)MR基因资源有限，目前已鉴定的白叶枯病MR基因只有40个左右，而其中已克隆的只有11个；(2)MR基因多具有病原菌致病小种特异性，抗病范围有限；(3)病原菌的快速变异，可能导致MR基因在进化过程中丧失抗性。介导数量抗性的基因一般被称为抗病相关基因(defense-responsivegene)，是指位于MR启动的抗病信号传导路径中的基因。据已有报道，大多数抗病相关基因在单独作用时的抗性可能比MR基因小，但由于多种原因，抗病相关基因也是值得大力开发的基因资源：(1)大多数抗病相关基因的编码产物不需要与病原菌直接互作，它们可能具有持久抗性；(2)多数抗病基因参与的抗病反应没有病原特异性，它们的抗性可能具有广谱性；(3)相对于MR基因而言，抗病相关基因的资源非常丰富。由此看出，MR基因和抗病相关基因各有优点，如果能在抗性育种中把这两种不同的抗性基因资源结合起来，通过超量对植物基础抗性和MR基因的抗性都有贡献的基因的表达，将进一步巩固和增强作物的抗病性，这是常规作物育种和改良技术所不能达到的。
技术实现思路
本专利技术的目的是从水稻品种中分离克隆OsTPI1-1基因，并利用超量表达和抑制表达遗传转化技术使该基因在水稻植株中超量表达或是抑制表达，鉴定其在水稻病原菌互作中的功能，利用该基因改良水稻抵御病菌侵害的能力。本专利技术的技术方案如下所述：首先利用酵母筛库技术筛选得到主效抗病蛋白XA3/XA26的互作蛋白，分析鉴定得到其中一个互作蛋白的编码基因OsTPI1-1，然后采用PCR技术从水稻品种中获得OsTPI1-1基因序列，进一步在大肠杆菌中表达OsTPI1-1蛋白并证明OsTPI1-1蛋白具有磷酸丙糖异构酶活性。同时采用农杆菌介导的遗传转化方法在水稻中分别超量表达和抑制表达OsTPI1-1基因，对遗传转化的水稻植株进行抗病性分析，证明OsTPI1-1基因能够增强水稻抗病性，也为主效抗病基因Xa3/Xa26抗病功能的正常发挥所必需。本专利技术涉及的OsTPI1-1基因赋予水稻对白叶枯病害产生抗病反应。该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，或基本相当于SEQIDNO:1所示的序列。对其序列进行分析表明，它编码一种磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase，TPI)。超量表达OsTPI1-1基因可以增强水稻对白叶枯病菌的抵抗能力，抑制表达OsTPI1-1基因则使Xa3/Xa26介导的水稻白叶枯病菌抗性减弱。可以采用已经克隆的OsTPI1-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的OsTPI1-1基因以及任何感兴趣的一段核苷酸或与其同源的一段核苷酸。采用以上技术，可以分离得到包含OsTPI1-1基因的序列或者包含一段OsTPI1-1基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，并超量表达OsTPI1-1基因，产生抗病转基因植物或是提高携带MR基因Xa3/Xa26的水稻材料中的抗病稳定性。本专利技术为增强水稻对白叶枯病的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsTPI1-1基因的完整编码区与能够超量表达目标基因的载体连接、转入水稻，通过超量表达OsTPI1-1基因改良水稻对白叶枯病的抵抗能力。在本专利技术在实例部分，申请人阐述了OsTPI1-1基因的鉴定分离、功能验证和该基因的特点。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术分离克隆的OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的核苷酸序列。序列表SEQIDNO:2是OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因编码的蛋白质序列。图1：本专利技术鉴定水稻抗病基因OsTPI1-1及验证OsTPI1-1基因功能的流程图。图2：OsTPI1-1(即OsTPI1.1)在酵母双杂交实验中与XA3/XA26胞内区域XA3/XA26768互作。附图标记说明：阳性对照为转化了Clontech公司提供的阳性质粒的酵母细胞；阴性对照为转化了Clontech公司提供的阴性质粒的酵母细胞。二缺培养基为缺陷亮氨酸和色氨酸的合成培养基；四缺培养基为缺陷亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的合成培养基。蛋白之间的互作通过酵母细胞在四缺培养基中的生长状况判定。图3：OsTPI1-1(即OsTPI1.1)蛋白具有磷酸丙糖异构酶活性。附图标记说明：融合的GST-OsTPI1-1蛋白可以催化甘油醛-3-磷酸(GAP)和二羟丙酮磷酸(DHAP)之间的转换。代谢物通过液相色谱质谱联用仪检测。GST蛋白用作阴性对照。图4：本专利技术所用到的遗传转化载体的结构示意图。附图标记说明：RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因(遗传转化筛选基因)。其中：图4中的A图为OsTPI1-1(即OsTPI1.1)超量表达的遗传转化结构图，PUbi表示玉米泛素基因启动子，TEVL表示烟草蚀刻病毒的5′非翻译区，NOS表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；图4中的B图为OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.OsTPI1-1基因在增强水稻对白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述OsTPI1-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.OsTPI1-1基因在增强水稻对白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述OsTPI1-1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.OsTPI1-1基因在增强水稻对白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述OsTPI1-1基因编码的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王石平，刘艳艳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42