尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及在制备维生素B

Uroporphyrinogen \u2162 synthetase mutants, mutant genes and their application in the preparation of vitamin B12

【技术实现步骤摘要】
尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及到尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体及其编码基因，和在制备维生素B12中的应用。
技术介绍
维生素B12(VB12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B12参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。由于维生素B12分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。目前，国内外针对维生素B12生产菌生物合成维生素B12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb基因来增加细胞生产维生素B12的能力（程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期）。本专利技术人前期筛选出了一株高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B12。而在苜蓿中华根瘤菌中，ALA（5-氨基乙酰丙酸）和尿卟啉原Ⅲ是维生素B12合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB，由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC，由基因hemC编码)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD，由基因hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ（HuanFang,JieKang,DaweiZhang*.MicrobialproductionofvitaminB12:Areviewandfutureperspectives.MicrobialCellFactories.2017Jan30;16(1):15.doi:10.1186/s12934-017-0631-y.）。目前，尚未有尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD用于维生素B12合成的报道。
技术实现思路
本专利技术人对前期筛选出的高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638菌株（CN104342390A），通过对其进行诱变，获得一株产维生素B12能力提高的诱变菌株。本专利技术作了进一步研究以发现对产维生素B12能力有影响的基因。经过研究发现尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B12的能力。首先，本专利技术提供一种尿卟啉原Ⅲ合成酶基因的突变体，其特征在于，其氨基酸序列相对于如SEQIDNO：4所示的多肽具有下述突变：第53位氨基酸替换为V，和第173位氨基酸替换为S。更优选，其氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。其次，本专利技术提供编码如上述的尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体的编码基因。更优选地，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。第三方面，本专利技术提供尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因或其突变体的编码基因在在制备维生素B12中的应用。在具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。更优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCCNO.9638保藏号的菌株。其中优选地，所述尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因编码具有SEQIDNO：4所示氨基酸序列的多肽；所述尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体编码基因编码具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示氨基酸序列的多肽，优选地所述尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因具有SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示核苷酸序列。其中，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。经研究证实，本专利技术中，过表达尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因的工程菌生物安全，可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力。经过实验，数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B12的能力达12.5%，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B12的能力即提高20%以上。附图说明图1：质粒载体pBBR-P21-hemD的结构图。图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB12产量。图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。图4：维生素B12的标准曲线图。具体实施方式本专利技术的以下实施例和附图仅说明实现本专利技术的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本专利技术的限制，任何在不脱离本专利技术的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本专利技术的保护范围之内。本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。培养基配方：LB培养基（g/L）：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH4)2SO41，(NH4)2HPO42，MnSO4·H2O0.8，CoCl2·6H2O0.02，MgO0.3，DMBI0.01，ZnSO4·7H2O0.01，CaCO31.5,pH通过NaOH控制在7.0～7.4。发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH4)2SO42，MgSO41.5,K2HPO40.75，CoCl2·6H2O0.14,DMBI0.075，ZnSO4·7H2O0.08，CaCO31，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。维生素B12的检测方法（1）样品预处理取1mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀=0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl2%的NaCN(w/v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。（2）标准品的制备配置梯度维生素B12标准品(20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L)。（3）HPLC检测条件C18-250A柱（Agilent，4.6mmid9×250mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量20µL。（4）维生素B12标准曲线的绘制将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB12浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B12质量浓度C（mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列相对于如SEQ ID NO：4所示的多肽具有下述突变：第53位氨基酸替换为V，和第173位氨基酸替换为S。/n

【技术特征摘要】
1.一种尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列相对于如SEQIDNO：4所示的多肽具有下述突变：第53位氨基酸替换为V，和第173位氨基酸替换为S。


2.编码如权利要求1所述的尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体的编码基因。


3.如权利要求2所述的尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。


4.尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因在制备维生素B12中的应用，其中所述尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因编码具有SEQIDNO：6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，董会娜，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12