本发明专利技术涉及生物技术中病毒技术领域，特别涉及一种突变口蹄疫病毒感染性克隆，还涉及此感染性克隆的制备及应用。通过定点突变技术将3C蛋白第51、54、110、159位赖氨酸突变为精氨酸。本发明专利技术构建的突变感染性克隆FMDV IC‑K5154110159R，其3C蛋白的SUMO化修饰位点已突变掉，并且该感染性克隆能够增殖，为在病毒水平检测及研究FMDV感染与SUMO化修饰提供强有力的工具。
Infectious cloning of a mutant foot-and-mouth disease virus and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种突变口蹄疫病毒感染性克隆及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物技术中病毒
，特别涉及一种突变口蹄疫病毒感染性克隆，还涉及此感染性克隆的制备及应用。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mousedisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mousediseasevirus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病的暴发流行，给畜牧业生产和人民生活造成了极大的损失，被国际兽医局列为A类动物传染病之首。FMDV属于微RNA病毒科、口蹄疫病毒属，基因组为单股正股RNA，全长约8500bp，由5’端非编码区(UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3’端非编码区(UTR)组成。ORF编码一个大的多聚蛋白，由病毒编码的蛋白酶切割(Lpro，2A和3Cpro)，经过一系列裂解，形成前体和成熟的结构蛋白及非结构蛋白。SmallUbiquitin-likeModifier(SUMO)小泛素样修饰，是近些年来发现的一种与泛素化修饰具有相似酶促反应过程的翻译后修饰。SUMO化修饰具有多种生物学功能，例如维持基因组稳定性、调控转录因子活性、介导蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在细胞内的定位或稳定性、参与信号转导以及DNA损伤修复等。对病毒而言，很多病毒的蛋白可以被SUMO化修饰，在病毒感染的过程中发挥重要的调控作用。目前关于SUMO化修饰在FMDV感染过程中的作用未见任何报道。
技术实现思路
为了进一步在病毒水平鉴定3C蛋白的SUMO化修饰位点及3C蛋白的SUMO化修饰对病毒增殖等的影响，十分有必要构建一株FMDV3C蛋白SUMO化修饰位点突变体感染性克隆，该感染性克隆将会是分子水平研究FMDV与宿主之间的相互作用、揭示机体抗病毒机制过程中非常重要的工具。本专利技术提供了一种突变口蹄疫病毒感染性克隆，还涉及此感染性克隆的制备及应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：一株3C蛋白SUMO化修饰位点突变的FMDV感染性克隆是通过以下步骤得到的：根据O型FMDVTibet/CHA/99株(GenBank登录号：AJ539138)自身携带酶切位点将碱基序列分为A、B、C三段，通过RT-PCR扩增获得A、B、C三个片段，将A、B、C三个片段依次克隆入pBluescriptIISK+载体构建有O型FMDVTibet/CHA/99株全长cDNA的质粒pSK-AmBC，然后通过定点突变技术将3C蛋白第51、54、110、159位赖氨酸突变为精氨酸构建FMDVICK5154110159R。将PacI酶线性化后的pSK-AmBC片段为模板体外转录后转染BHK-21细胞获得。所述的感染性克隆，优选RT-PCR扩增获得A、B、C三个片段，其中3C基因位于C片段中，以构建的pT-BC为模板，3CK5154R-F/R、3CK110R-F/R、3CK159R-F/R为引物，通过QuikChangeXLsite-directedmutagenesiskit将突变位点顺次引入pT-BC中构建pT-BCK5154110159R，然后用NotI和PacI将突变片段从pT-BCK5154110159R中克隆到pSK-Am中构建pSK-AmBCK5154110159R。用PacI酶将质粒pSK-AmBC线性化，用线性化并纯化的片段作为模板，通过mMESSAGET7UltraKit根据说明书进行体外转录，用DEPC水将获得的RNA沉淀重悬测定浓度后备用或置于-70℃保存。将BHK-21细胞铺入6孔板，待细胞密度达80％时，用10μLDMRIE-C将5μgRNA转染BHK-21细胞。4h后洗一遍并更换新鲜的营养液。转染后48h，收集上清并在PK-15细胞上盲传5代。突变口蹄疫病毒感染性克隆在干扰素信号通路抑制中的应用。突变口蹄疫病毒感染性克隆在诱导凋亡中的应用。突变口蹄疫病毒感染性克隆在3C蛋白稳定性方面的应用。突变口蹄疫病毒感染性克隆在提高病毒滴度方面的应用。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术构建的突变感染性克隆FMDVIC-K5154110159R，其3C蛋白的SUMO化修饰位点已突变掉，并且该感染性克隆能够增殖，为在病毒水平检测及研究FMDV感染与SUMO化修饰提供强有力的工具；(2)通过测定TCID50及一步生长曲线表明，本专利技术构建的感染性克隆FMDVIC-K5154110159R的病毒滴度为107.5TCID50/mL，并且在24h、36h、48h明显高于野生型感染性克隆(P<0.01)；(3)突变体感染性克隆FMDVIC-K5154110159R产生更强的CPE病变；突变体感染性克隆FMDVIC-K5154110159R3C蛋白半衰期为3.5-4h，明显高于野生型感染性克隆FMDVIC-WT3C蛋白的2.6h(P<0.01)；突变体感染性克隆FMDVIC-K5154110159R引起更强的PARP-1的切割(P<0.01)及细胞凋亡(P<0.01)；突变体感染性克隆FMDVIC-K5154110159R引起更多的KPNA1的降解；突变体感染性克隆FMDVIC-K5154110159R对ISRE启动子活性具有更显著的抑制。附图说明：图1为扩增O型FMDVTibet/CHA/99株FMDVA、B、C片段电泳图，其中1、2、3泳道分别为A、B、C片段RT-PCR产物；M为DL5,000DNAMarker，图2为本专利技术重组质粒pSK-AmBC双酶切鉴定图，其中1泳道为双酶切结果；M为DL10,000DNAMarker，图3为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒3C蛋白氨基酸序列比较，其中第51位、54位、110位、159位赖氨酸突变为精氨酸(图中星号所示)，图4为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒3C蛋白SUMO化修饰情况，其中箭头所示为3C蛋白的SUMO化修饰条带，图5为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒产生的CPE图，图6为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒的一步生长曲线，图7为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒3C蛋白的稳定性比较，图8为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒引起的细胞凋亡情况，图9为FMDVIC-K5154110159R感染性克隆与野生型感染性克隆IC-WT病毒引起的干扰素信号通路抑制情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例11.构建FMDVIC-K5154110159R感染性克隆1.1引物设计根据O型FMDVTibet/CHA/99株(GenBank登录本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种突变口蹄疫病毒感染性克隆，其特征在于其3C蛋白第51位、54位、110位、159位赖氨酸均突变为精氨酸。/n
【技术特征摘要】
1.一种突变口蹄疫病毒感染性克隆，其特征在于其3C蛋白第51位、54位、110位、159位赖氨酸均突变为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变口蹄疫病毒感染性克隆，其特征在于病毒滴度为107.5TCID50/mL。
3.根据权利要求1所述的突变口蹄疫病毒感染性克隆，其特征在于3C蛋白半衰期为3.5-4h。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的突变口蹄疫病毒感染性克隆的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取口蹄疫病毒病毒总RNA，反转录后使用上述引物通过RT-PCR扩增分别获得A、B、C三个片段，
（2）用AscI和NotI将含有T7启动子的A片段双酶切后克隆到pBluescriptIISK+载体中构建pSK-A；
（3）用FMDV-Am-Fwd/FMDV-Am-Rev引物通过QuikChangeXLsite-directedmutagenesiskit将NheI引入pSK-A中构建pSK-Am；
（4）先将B和C片段顺次连入TaKaRapMD18-T载体构建pT-BC，以此为模板，突变引物3CK5154R-F/3CK5154R-R、3CK110R-F/3CK110R-R、3CK159R-F/3CK159R-R为引物，将突变位点顺次引入pT-BC中构建pT-BCK5154110159R，然后用NotI和PacI将突变片段从pT-BCK5154110159R中克隆到pSK-Am中构建pSK-AmBCK5154110159R，将PacI酶线性化后的pSK-AmBCK5154110159R片段为模板体外转录后转染BHK-21细胞获得突变口蹄疫病毒感染性克隆；
其中步骤（1）中扩增A、B、C三个片段序列的引物，碱基序列如下：
A片段引物碱基序列如下
FMDV-A-Fwd：5’-TATGGCGCGCCTAATACGACTCACTATAGGTTGAAAGGGGGCGTTAGGG-3’；
FMDV-A-Rev：5’-TGAGCGGCCGCCTCAGGTGTTTTG-3’；
B片段引物碱基序列如下
FMDV-B-Fwd：5’-GAGGCGGCCGCTCACTGCATTCAT-3’；
FMDV-B-Rev：5’-TGTCCCGGGAGAGTTTTCTCTCTGA-3’：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴香菊，杜以军，齐静，丛晓燕，隋超，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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