一株产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及一种产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及该酶的生产方法。所述菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ‑215，保藏编号为CGMCC NO.18645。同时本发明专利技术并优化了相应的发酵机制，该发酵机制，发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在65000U/mL以上；由本发明专利技术生产的中性蛋白酶酶活力高、热稳定性好、性能稳定，具有广泛的应用前景。

Bacillus subtilis producing thermostable neutral protease and its application

【技术实现步骤摘要】
一株产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
：本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及该酶的生产方法。
技术介绍
：蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可以将大分子的蛋白质水解成为氨基酸和小肽等产物。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。外肽酶是从蛋白质分子的游离氨基酸或羧基的末端逐个将肽键水解，进而游离出氨基酸，前者称为氨基肽酶，后者称为羧基肽酶。按其活性中心可以将其分为巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。按其反应的最适pH值，可以将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中，中性蛋白酶作用条件温和，可以将其应用于制药、食品、皮革、纺织和化工行业，但是由于其热稳定性差，限制了它的工业化生产和广泛应用。高温中性蛋白酶具有良好的热稳定性，弥补了一般中性蛋白酶的不足，生产和使用条件简单，因而具有更加广阔的应用前景。由于酸性蛋白酶和碱性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，所以自20世纪70年代至今，研究和生产高温中性蛋白酶成为了酶学领域研究的热点之一。目前国外高温中性蛋白酶研究主要是集中在分子生物学与基因工程菌的构建，国内主要是集中在菌种的选育、酶的固定化技术、酶的分子生物学特性等方面的研究。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术提供一株能够生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，同时改进了发酵工艺，提高产中性蛋白酶的酶活，对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。本专利技术首先提供一株生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株由本实验室保存的一株枯草芽孢杆菌经物理和化学复合诱变后获得，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SJ-215，该菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.18645。本专利技术还提供枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SJ-215的发酵产酶方法，具体如下：(1)发酵培养a.发酵罐培养基：玉米淀粉8％、蛋白胨0.41％、NaNO30.6％、KH2PO40.2％、KCl0.05％、MgSO4·7H2O0.07％、CaCO31％，pH6.3；b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；c.发酵罐发酵工艺条件：2-4％接种量，罐压0.05-0.08MPa，培养温度30-32℃，搅拌转速200-220r/min，pH控制6.2-6.4；通风量：1-1.5vvm；(2)补料培养培养基质量体积百分比组成如下：a.补料培养基：玉米淀粉30％，玉米浆3％，氯化钙0.5％，pH6.3。b.补料培养基灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。c.补料方法：发酵培养期间，当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.2-6.4；(3)放罐发酵培养68-73h，酶活增长缓慢，菌体部分开始自溶，即可放罐；发酵结束时，发酵液中中性蛋白酶的酶活可以达到65000U/mL以上。(4)中性蛋白酶的提取发酵结束后，将发酵液经絮凝，压滤，澄清，超滤，加入稳定剂后获得成品。本专利技术获得的中性蛋白酶，酶学性质如下：(1)最适反应温度为75℃，在80℃时也具有较高的酶活；(2)75℃条件下保温1h其酶活基本不变，在80℃条件下保温1h酶活仍能保持90％以上的活性，当温度升至90℃时，酶活随着保温时间的延长下降为原来的65％左右；(3)pH为7.0附近时酶活最高；(4)在pH5.0-8.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。有益效果：1、本专利技术提供了一种适于工业化生产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在65000U/mL以上；2、由本专利技术生产的中性蛋白酶酶活力高、热稳定性好、性能稳定，具有广泛的应用前景。附图说明：图1最适作用温度曲线；图2温度稳定性曲线；图3最适作用pH曲线；图4pH稳定性曲线。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1菌株的诱变选育1、微波诱变：取5mL生长至对数生长期的菌悬液于试管中，将试管置于含冰块的烧杯中，使用频率为2450MHz，输出功率为700W的美的微波炉，按不同的时间逐个对试管进行照射，稀释梯度为10-1～10-6。取处理不同时间的菌液，并分别稀释，取3个梯度(10-4～10-6区间)的菌液0.1mL，涂布于筛选平板培养基上，30℃培养16h，计算菌落数，绘制致死率曲线。挑取透明圈较大的单菌落接种到种瓶中，再通过液体培养基测定每个菌株的中性蛋白酶酶活。选择中性蛋白酶产量较高，并且能够稳定遗传3代以上的菌株，作甘油管保藏，并且作为进一步硫酸二乙酯诱变的出发菌株。2、硫酸二乙酯(DES)诱变：取5mL生长至对数生长期的菌悬液加入到体积为25mL的三角瓶中，再分别加入0.1mL、0.2mL、0.3mL的DES(体积浓度50％)，震荡不同时间，加入0.5mL的硫代硫酸钠(85％)终止反应。取DES不同诱变剂量的菌悬液，并分别稀释，取3个梯度(10-4～10-6)的诱变悬液0.1mL，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养16h。计算菌落数，并绘制致死率曲线。挑取筛选平板上透明圈较大的单菌落接种到种瓶中，再通过液体培养基测定每个菌株的中性蛋白酶的酶活，选取酶活高的菌株进行保存。重复上述步骤进行诱变以及筛选，筛选出一株热稳定性提高的高产中性蛋白酶SJ-215，其酶活较高且能稳定遗传，摇瓶发酵酶活比出发菌株提高了2.6倍。3、中性蛋白酶高产菌株SJ-215的稳定性传代实验将中性蛋白酶高产菌株SJ-215于分离平板上划线分离，挑取透明圈较大且生长情况较好的单菌于种瓶培养基中，待生长至对数生长期时，按2％接种量接种到发酵摇瓶中，于30℃，240r/min条件下培养72h，测定酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：表1.菌株SJ-215稳定性检测结果将该突变菌株连续培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传稳定性良好。实施例2中性蛋白酶酶活测定方法1、酶活力的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH条件下，lmin水解酪蛋白产生lμg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。2、标准曲线的绘制：配制一系列不同浓度的L-酪氨酸标准溶液(0、10、20、30、40、50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ-215，保藏编号为CGMCC NO.18645。/n

【技术特征摘要】
1.一株生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，该菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SJ-215，保藏编号为CGMCCNO.18645。


2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产中性蛋白酶中的应用。


3.权利要求1所述菌株生产的中性蛋白酶。


4.权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，王兴吉，钱娟娟，宋静静，郭庆文，王克芬，刘胜利，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37