本发明专利技术公开了一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，本发明专利技术筛选得到一株双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)YJ32，保藏号为CGMCC NO.15922。本发明专利技术的拮抗菌株YJ32适生范围宽，易培养，对姜瘟病的病原菌具有靶向抑制作用，是一种防治姜瘟病效率高、环境友好的生防菌株，应用前景广阔。
An antagonistic strain yj32 against ginger blast and its application
【技术实现步骤摘要】
一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用
本专利技术涉及一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，属于微生物技术及生物防治领域。
技术介绍
姜瘟病又称姜青枯病，主要由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引发，传播途径多，危害大，一旦感染，可导致生姜20-80％减产乃至绝收，对生姜生产及产区经济发展造成巨大影响，已成为制约生姜产业发展的瓶颈问题。但是，由于目前缺乏理想的防治方法，姜瘟病一直未能得到有效控制。姜瘟病属于土传细菌性病害，采用化学杀菌方法防治，效果不明显，很难从根本上根除姜瘟病的发生，且易造成生姜中有害化学物质的残留以及环境污染等问题。生物防治姜瘟病，是利用拮抗菌靶向防控病原菌，具有高效、无毒、绿色环保等特点，是一条有效的防控途径。然而，目前报道的有关姜瘟病高效拮抗菌株以及应用于田间的有效生防菌剂较少。本专利技术将提供一种能有效防治姜瘟病土传病害的拮抗菌及其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：1、姜瘟病拮抗菌YJ32的筛选与鉴定，包括以下步骤：(1)菌株分离与纯化在姜瘟病发病区，采集姜瘟病土样和染病姜块多份。取土样和姜块，按照土样(姜块)∶无菌生理盐水为1∶9比例，进行10倍梯度稀释，依次得到10-1-10-8梯度的菌悬液，采用涂布分离法，将上述10-4-10-8菌悬液分别在牛肉膏蛋白胨、LB、无机盐与马铃薯固体培养基平板上涂布，于25℃-37℃，培养2-7d，分离菌株。然后，采用平板划线法，在同种培养基上划线，纯化菌株，得到不同的单菌落菌株。挑取上述纯化好的单菌落，分别接种于牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基中，于25-37℃，150-200r/min条件下，震荡培养1-2d，得到各纯化菌株菌液。(2)靶标致病菌的培养与TZC固体平板制备选择青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstoniasolanacearum)和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobactermori)2种姜瘟病的病原菌，作为靶标致病菌。将试管斜面保存的青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2，分别接种于LB液体培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28-32℃、150-200r/min条件下，震荡培养24-48h，制备得到Z-A9-1和JLIY2菌液，用生理盐水分别将其OD600值调为1.00，然后各取15-20ml，分别添加到1L已在121℃灭菌20min，且冷却至40℃-50℃的TZC固体培养基中，摇均匀后，倒平板，分别得到含有Z-A9-1和JLIY2靶标致病菌的TZC固体平板。青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstoniasolanacearum)：由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，菌种保藏号为ACCCNo.60145。桑细菌性萎蔫病菌JLIY2(Enterobactermori)，由本实验室从姜瘟病染病土样中分离得到，现保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCCNo.60119，保藏地址：北京市海淀区中关村南大街12号。(3)姜瘟病拮抗菌的筛选与鉴定采用双靶标菌抑制法，筛选姜瘟病拮抗菌株。具体为：在上述含有Z-A9-1和JLIY2病原菌的TZC固体平板上，分别采用点接法，接种上述(1)中得到的各纯化菌株的菌液4-8ul，每个平板均匀接种4-6个不同菌株的菌液，然后置于28-32℃条件下，培养2-7d。每天观察并挑选出对2种靶标致病菌Z-A9-1和JLIY2均具有抑菌圈的菌株，并测量抑菌圈直径，从中挑选出抑菌圈大菌株，由此筛选得到对青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2两种病原菌的生长，均具有强抑制作用的拮抗菌株YJ32。TZC固体培养基配置：蛋白胨10.0g，酸水解酪蛋白1.0g，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)0.05g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1L，pH6.8-7.2，琼脂10g-15g，121℃灭菌20min(注TTC配成1％溶液，0.22um滤膜过滤，待培养基冷却到50℃左右时加入，摇均匀)。本专利技术的拮抗菌YJ32，显微观察呈杆状，在牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养1-3d，菌落直径3-7mm，乳白色，表面粗糙，无光泽，扁平，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形。经过16SrDNA提取，PCR扩增与测序，序列比对，进化树构建，并结合形态特征观察，确定YJ32菌株为Burkholderiaambifaria，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(BurkholderiaambifariaYJ32)。该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.15922。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2、本专利技术菌株YJ32的培养方法，其特征在于，菌株YJ32培养可选用牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基培养基、马铃薯培养基、无机盐培养基、TZC培养基进行培养；该菌株对pH值适应性宽，在pH值为3.0-11.0的培养基中均能生长，其中，在pH值在5.0-9.0之间生长较好。3、菌株YJ32对姜瘟病病原菌的拮抗作用菌株YJ32通过种子液制备、发酵培养，离心或过滤，分离等操作环节获得培养物，包括发酵液、代谢产物和菌体；通过实验发现它们对青枯雷尔氏菌Z-A9-1和桑细菌性萎蔫病菌JLIY2均具有拮抗作用；同时发现，发酵液对土壤中姜瘟病病原菌，也具有拮抗作用。菌株YJ32及其培养物可直接应用于姜瘟病的预防或制成菌剂用于姜瘟病的预防。使用方法简单，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用。本专利技术的有益效果1、本专利技术提供的姜瘟病拮抗菌株YJ32，对引起姜瘟病的病原菌青枯假单胞菌(Ralstoniapseudosolanacearum)与桑树性细菌萎蔫病(Enterobactermori)，均具有强抑制作用，可靶向预防姜瘟病。2、本专利技术提供的菌株YJ32，适生条件范围宽，易培养，在多种培养基中能生长，如在无机盐、马铃薯、牛肉膏蛋白胨、LB培养基中均可生长，生长速度快，对pH适应性强，在pH值为5-9条件下生长较好，适应多种不同pH值土壤。3、本专利技术提供的菌株YJ32及其培养物，包括发酵液、菌体、代谢产物等，对姜瘟病病原菌均有拮抗作用，可直接应用或做成菌剂，应用于姜瘟病防治，持效期长。4、本专利技术提供的菌株YJ32及其培养物，制备工艺简单，可以一年四季生产。施用方法灵活，可叶面喷施，根施，也可以结合滴灌、微灌和浇水等一块施用，避免了现有化学方法污染等弊端，是一条绿色环保、且有效的方法。附图说明图1为菌株YJ32的菌落形态图。图2为菌株YJ32的系统发育树。图3为菌株YJ32在牛肉膏蛋白胨培养基中生长曲线。图4为菌株YJ32及其培养物对Z-A9-1菌的抑菌圈(其中上方为YJ32菌体，左下方为YJ32发酵液的上清液，右下方为YJ32发酵液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，其特征在于：通过形态特征观察与分子生物学鉴定，确定菌株YJ32为Burkholderia ambifaria，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(Burkholderia ambifaria YJ32)；该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.15922。/n
【技术特征摘要】
1.一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32及其应用，其特征在于：通过形态特征观察与分子生物学鉴定，确定菌株YJ32为Burkholderiaambifaria，并命名为双向伯克霍尔德氏菌YJ32(BurkholderiaambifariaYJ32)；该菌株于2018年6月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.15922。
2.根据权利要求1所述的一种防治姜瘟病的拮抗菌YJ32，其特征在于，菌株YJ32的筛选方法，所述方法包括：(1)菌株分离与纯化，采集姜瘟病土样和染病姜块多份，采用梯度稀释与涂布法分离菌株，并利用平板划线法纯化菌株，得到不同纯化菌株；(2)靶标致病菌的培养与TZC固体平板制备：将青枯雷尔氏菌Z-A9-1(Ralstoniasolanacearum)与桑细菌性萎蔫病菌(Enterobactermori)2种病原菌，分别接种于LB液体培养基或牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28-32℃、150-200r/min条件下，培养24-48h，制备得到2种病原菌菌液，用生理盐水分别将其OD600值调为1.00，然后分别取15-20ml，添加到1L已在121℃灭菌20min，且冷却至40℃-50℃的TZC固体培养基中，摇匀后，倒平板，分别得到含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1与桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板；(3)拮抗菌的筛选与鉴定，取不同纯化菌株，分别接种于牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基中，于25-37℃摇床中培养1-2d，得到各纯化菌株菌液，取菌液4-8u，采用点接法，分别接种到含有青枯雷尔氏菌Z-A9-1与桑细菌性萎蔫病菌JLIY2的TZC固体平板中，置于28-32℃条件下培养2-7d；每天观察并挑选出对2种病原菌生长均具有抑制作用，且抑菌圈大菌株，由此筛选得到拮抗菌株YJ32。
3.根据权利要求1所述的拮抗菌YJ32，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢建辉，李艳菊，李超，刘晓倩，陈卫琦，
申请(专利权)人：山东华田益农生物科技有限公司，李艳菊，
类型：发明
国别省市：山东;37
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