一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脱细胞支架溶液‑GelMA水凝胶复合材料及制备方法，将脱细胞支架溶液混合溶于GelMA水凝胶中，采用生物化学酶解和物理搅拌结合的方法构建多孔结构的复合支架材料。本发明专利技术以GelMA为基体以保证支架的机械强度和生物降解性；复合脱细胞支架溶液旨在提高生物相容性，保留原器官中生物活性因子和天然的细胞外基质成分，促进细胞在支架上黏附和增殖。该方法制备的复合支架具有孔隙大小可调控、机械性能好，生物相容性好、活性因子多等优点，可作为一种优良的生物材料应用于组织工程领域。

A decellularized scaffold solution -GelMA hydrogel composite material and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法
本专利技术涉及生物材料
，尤其是涉及一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法。
技术介绍
细胞外基质材料是工程化组织构建的主要成分之一。理想的支架材料应满足以下特点：1）必须是三维多孔的网络结构，有利于细胞生长和营养及代谢物的转运，且孔隙大小和孔隙率易于调控，为血管生成创造条件；2）必须具有可降解性和良好的生物相容性，支架空间结构和表面化学特性需适应细胞黏附、增殖和分化；3）易于加工成各种形状和尺寸；4）整体器官的支架（包膜和管道系统）与细胞外基质的有机整合。近年来的研究显示，水凝胶作为细胞外基质材料可为肝细胞的生长和分化提供比较合适的生长环境，能支持肝细胞在支架内比较长时间的生长。另外水凝胶材料均存在流动态和半固体状态，不仅可以同种子细胞均匀混合，而且，可以采用注射的方式植入体内，从而大大减小对植入部位管道和微环境的破坏。同合成水凝胶相比，天然水凝胶含有多种整合锚定位点和生长因子，因而可刺激包括增殖和分化在内的多种信号通路。天然水凝胶中可用于肝组织工程的有基质胶，纤维蛋白胶，胶原，壳聚糖等。近年来开发的一种新型的光敏水凝胶材料—甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）得到了学者们的广泛青睐，其优点包括：结构上具有细胞粘附位点及基质金属蛋白酶水解位点，故可良好支持细胞的增殖及迁徙；甲基丙烯酸酐基团的存在使其具有光敏性，能够在紫外光照射下快速交联；理化性能灵活可调；能够通过诸多微制造工艺，如生物打印、光刻技术、自组装、微流体技术等，制造出具有独特形貌特点的结构单元。GelMA水凝胶已被证明在骨、软骨、心肌、血管等组织再生方面的独特优势，并且在基础细胞研究、细胞信号转导、药物/基因控释及生物感应等领域亦取得了较好的结果。但是这些都是单一的组份，无法完全模拟器官体内环境，生物学性能也有限。于是，利用脱细胞技术直接去除组织中会引起免疫排斥反应的细胞和DNA,将剩下的保留有天然组织大部分成分的脱细胞基质作为支架材料,在组织工程的各个方面，如神经、肝脏、骨、肌肉、肌键、心脏等方面的研究逐渐增多。脱细胞基质在皮肤再生/修复、神经修复、防粘连膜、组织填充等方面已经有上市的应用产品。这些脱细胞基质材料虽然保留了主要的活性成分，但在脱细胞的处理过程中和植入体内后难免会发生形变、内部空间坍塌等现象，具有批次差异性，很难实现与患者伤处的匹配。因此，本专利技术提供一种快速脱细胞技术，并且利用物理化学手段得到脱细胞基质溶液与GelMA水凝胶结合成复合材料，保留了传统水凝胶的优点同时增加了脱细胞材料的天然成分，为组织工程领域发展提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术克服了传统的天然高分子凝胶组分单一，生物功能单一的缺点。传统的脱细胞基质材料易变形，批次差异性大，加工性差，难以与患者伤处充分匹配的缺点，本专利技术提供了一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料制备方法。本专利技术制备方法是将脱细胞基质经过打粉、消化并与GelMA水凝胶混合成胶。该成胶技术可用于可注射凝胶以及可加工成型凝胶两个方面，并且形成的凝胶具有多孔结构，该结构对于调节细胞行为，使其充分接触外界营养方面具有积极效应。为此，本专利技术采用以下技术方案：首先，本专利技术提供一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料，其特征在于，包括如下组分：脱细胞基质、GelMA、交联剂，其中，脱细胞基质存在于脱细胞基质液中，脱细胞基质在脱细胞基质液中的浓度为1~2mg/ml，GelMA存在于蒸馏水配制的10%wtGelMA水凝胶中，交联剂为1%wt光引发剂，其中，GelMA水凝胶与光引发剂的质量比为100:1，脱细胞基质液与GelMA水凝胶的体积比为1:1-1:9。同时，本专利技术还提供一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）取脱离载体的动物器官在常温下灌注SDS和TritonX-100水溶液，脱去组织中的细胞和核酸物质，获得脱细胞支架；（2）将步骤（1）获得的脱细胞支架冷冻干燥，剪碎，获得脱细胞基质块，用胃蛋白酶溶液消化基质块12~48h；（3）用10xPBS终止消化，加入NaOH溶液调节脱细胞基质液PH至中性；（4）将中性的脱细胞基质液用超滤管进行超速离心，获得浓缩的脱细胞基质液；（5）将浓缩的脱细胞基质液和10%质量比的GelMA按一定比例混合，超声搅拌至均匀分布，加入相应的光引发剂，在紫外光照下进行光交联即得到脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料。进一步地，所述步骤（1）中脱细胞支架的制备方法包括以下步骤：（1）获取新鲜器官：取新鲜完整的动物器官，通过静脉或动脉插管，用止血钳将插管与脉管固定，小心取出完整器官，将其置于无菌平皿用PBS冲洗多余血细胞后置于-80℃冰箱，反复冻融2~5次；（2）对器官进行脱细胞处理：通过脉管先灌流PBS1~2h去除血细胞，再灌流0.1%SDS6~10h,TritonX-1000.5~1h,用DNA酶和RNA酶混合溶液灌洗器官10~30min去除多余的核质，最后用PBS冲洗2~4h，保存于含双抗和两性霉素的混合溶液里。进一步地，所述步骤（1）中，制备脱细胞基质溶液的步骤包括：（1）将脱细胞支架冷冻干燥，剪碎成粉末，用胃蛋白酶的盐酸溶液消化剪碎的基质在摇床处理12~48h，待其溶解成均一的溶液；（2）在脱细胞基质溶液中加入其1/10~1/20体积的10xPBS溶液，终止酶消化，再加入NaOH(5M)使脱细胞基质溶液至中性（pH=7.0~7.4）；（3）将中和的脱细胞基质溶液转移到超滤管中，5000~6000g4℃离心1~2h,收取浓缩的脱细胞基质液。进一步地，所述步骤（1）脱细胞流速为10mL/min~20mL/min。进一步地，所述步骤（2）胃蛋白酶溶液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液，其中，盐酸溶液的浓度为0.1~0.5M，胃蛋白酶的浓度为0.5~5mg/mL。进一步地，所述胃蛋白酶用量与脱细胞基质的比例为1~5mg脱细胞支架溶于1~10mL胃蛋白酶盐酸溶液。进一步地，所述步骤（5）中光引发剂的浓度为1~2%wt。进一步地，所述步骤（5）中紫外光波长为365nm,光照时间为30~60秒。进一步地，所述步骤5的脱细胞基质溶液与GelMA混合比例大于1：1，其中，所述GelMA配制方法为0.1gGelMA溶于1mL水溶液或培养基溶液。本专利技术制备所得的脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料，其孔隙可调，有利于营养物质的交换。上述脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料与部分天然组织模量可能有差异，因此若需模拟模量较大的组织，可以通过加大GelMA本身浓度增加复合材料的力学强度。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果:本专利技术的脱细胞基质的成分与天然组织成分基本接近,可以提供良好的生物功能，模拟体内真实环境。本专利技术的脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料，其特征在于，包括如下组分：脱细胞基质、GelMA、交联剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料，其特征在于，包括如下组分：脱细胞基质、GelMA、交联剂。


2.一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取脱离载体的动物器官在常温下灌注SDS和TritonX-100水溶液，脱去组织中的细胞和核酸物质，获得脱细胞支架；
（2）将步骤（1）获得的脱细胞支架冷冻干燥，剪碎，获得脱细胞基质块，用胃蛋白酶溶液消化基质块12~48h；
（3）用10xPBS终止消化，加入NaOH溶液调节脱细胞基质液PH至中性；
（4）将中性的脱细胞基质液用超滤管进行超速离心，获得浓缩的脱细胞基质液；
（5）将浓缩的脱细胞基质液和10%质量比的GelMA按一定比例混合，超声搅拌至均匀分布，加入相应的光引发剂，在紫外光照下进行光交联即得到脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料。


3.根据权利要求2所述的一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中脱细胞支架的制备方法包括以下步骤：
（1）获取新鲜器官：取新鲜完整的动物器官，通过静脉或动脉插管，用止血钳将插管与脉管固定，小心取出完整器官，将其置于无菌平皿用PBS冲洗多余血细胞后置于-80℃冰箱，反复冻融2~5次；
（2）对器官进行脱细胞处理：通过脉管先灌流PBS1~2h去除血细胞，再灌流0.1%SDS6~10h,TritonX-1000.5~1h,用DNA酶和RNA酶混合溶液灌洗器官10~30min去除多余的核质，最后用PBS冲洗2~4h，保存于含双抗和两性霉素的混合溶液里。


4.根据权利要求2所述的一种脱细胞支架溶液-GelMA水凝胶复合材料及制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，制备脱细胞基质溶液的步骤包括：
（1）将...

【专利技术属性】
技术研发人员：王书崎，陆思铭，梁利国，王怡敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33