京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及组织修复技术领域，具体而言，涉及京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法；该制备方法包括混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育；本发明专利技术的方法制备的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。

Geniping cross-linked fibrous annulus acellular matrix hydrogel and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法
本专利技术涉及组织修复
，具体而言，涉及京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法。
技术介绍
椎间盘退变(IVDD)是导致腰痛的主要原因；相关技术用于治疗椎间盘退变(IVDD)的材料存在机械强度低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法，其制备的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施例提供一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育。在可选的实施方式中，孵育的温度为35-40℃。在可选的实施方式中，混合纤维环脱细胞胶和京尼平后，京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)。在可选的实施方式中，纤维环脱细胞胶的制备方法包括：用消化溶液消化脱细胞纤维环。在可选的实施方式中，消化溶液包括胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液中的至少一种。在可选的实施方式中，用消化溶液消化脱细胞纤维环之前还包括：将脱细胞纤维环和乙醇分别盛装于不同的容器，并放入培养箱中对脱细胞纤维环灭菌后；再将脱细胞纤维环转移至无菌操作台，在紫外照射下，挥发乙醇。在可选的实施方式中，脱细胞纤维环的制备方法包括：混合细胞工作液和纤维环，然后反复冻融；震荡、离心后弃上清液；添加去污剂，混合后离心；弃上清液，添加核酸内切酶，混合后离心；弃上清液，加水洗涤后，干燥。在可选的实施方式中，每次冻融包括用液氮冷冻8-12min，在水浴锅解冻25-35min。在可选的实施方式中，细胞工作液包括：Tris-HCl、TritonX-100、EDTA和抑肽酶中的至少一种；去污剂包括：十二烷基磺酸钠和胰蛋白酶溶液中的至少一种。第二方面，本专利技术实施例提供一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶，其是由前述实施方式任一项的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法制备的。本专利技术实施例的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的有益效果包括：纤维环脱细胞胶和京尼平混合孵育后，能够形成京尼平交联的纤维环脱细胞凝胶结构，该结构中的孔隙较少，具有致密的结构，且与京尼平交联后还能提高凝胶组织的储存模量；由此可见，本专利技术提供的制备方法能够改善制得的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。本专利技术实施例的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的有益效果包括：本专利技术提供的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为专利技术实施例中京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的流程图；图2为对实施例2的脱细胞纤维环(DAF)和新鲜的纤维环组织(FAF)进行HE染色和DAPI染色的结果；图3为实施例2-1的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)进行电镜观察结果；图4为实施例2的脱细胞纤维环和新鲜的纤维环组织的DNA和GAG含量图；图5为各种不同京尼平含量的纤维环脱细胞水凝胶的储存模量结果图；图6为实施例2-1、2-2、2-3的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶进行细胞活力检测的结果；图7为实施例2-1、2-2、2-3的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶的LDH细胞毒性测试的结果；图8为将细胞接种于ColI以及实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)的结果图；图9ColI以及实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向纤维环细胞方向分化的检测结果图；图10为实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)用于进行大鼠纤维环缺损模型体内修复能力检测结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下对本专利技术的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法作进一步的详细描述。图1为专利技术实施例中京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的流程图；请参照图1。本专利技术的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵化；这样一来，可以形成京尼平交联的纤维环脱细胞凝胶结构，该结构中的孔隙较少，具有致密的结构，且与京尼平交联后还能提高凝胶组织的储存模量；由此可见，本专利技术提供的制备方法能够改善制得的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。本专利技术的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法还包括：调节纤维环脱细胞水凝胶的pH值，使得纤维环脱细胞水凝胶的pH值为7.0-7.4；调节纤维环脱细胞水凝胶的方法例如可以是：取一定量的纤维环脱细胞水凝胶至于离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，例如：再向离心管中加入1/100纤维环脱细胞水凝胶体积的1M的氢氧化钠溶液震荡混匀，再用0.1M的氢氧化钠溶液和0.1M的盐酸溶液交替滴加于离心管中并震荡混匀，直到管内溶液的pH值达到7.0-7.4。需要说明的是，在调节纤维环脱细胞水凝胶之前还可以先取少量(例如：300ul)用于制备纤维环脱细胞水凝胶的脱细胞基质预成胶，并调整预成胶的pH，记录调整pH时，使用的酸碱比例，以便于后续调整纤维环脱细胞水凝胶的pH值时快速开展工作，并减少浪费。在调整pH后，添加10X磷酸盐缓冲溶液于调整过pH的纤维环脱细胞水凝胶中，混匀后，在37℃左右下孵育构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。在制得了纤维环脱细胞胶(DAF-G)后，先添加10X磷酸盐缓冲溶液，在加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)，混匀后，在37℃左右条件下孵育，即可构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。在较优的实施例中，京尼平的终浓度为0.02本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育。/n

【技术特征摘要】
1.一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育。


2.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为35-40℃。


3.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，混合所述纤维环脱细胞胶和所述京尼平后，所述京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)。


4.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述纤维环脱细胞胶的制备方法包括：用消化溶液消化脱细胞纤维环。


5.根据权利要求4所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述消化溶液包括胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液中的至少一种。


6.根据权利要求4所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，用所述消化溶液消化所述脱细胞纤维环之前还包括：将所述脱细胞纤维环和乙醇分别盛装于不同的容器，并放入培养箱中对所述脱细...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭一中，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42