RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用，在VERO细胞中插入RAGB编码基因编码片段，转录RAGB蛋白，对改变VERO细胞的生长能力以及基因表达能力，提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率和表达效率是有益的。

【技术实现步骤摘要】
RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用
本专利技术涉及RAGB编码基因插入的VERO细胞株及其构建方法和应用，属于生物技术及兽用生物制品工程

技术介绍
绿猴肾(VERO)细胞是目前用于猪流行性腹泻病毒增殖的主要的宿主细胞。各大研究机构以及兽用疫苗生产企业都在进行该细胞增殖猪流行性腹泻病毒的种细胞筛选、细胞悬浮培养、病毒增殖工艺等研究。在研究中我们发现，当猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的连续传代时，其增殖效率呈现出逐渐下降的趋势。甚至在连续增殖到某一代次时，猪流行性腹泻病毒的增殖效率会出现断崖式下降。造成这一情况发生的原因主要在于子代猪流行性腹泻病毒粒子的增殖效率下降与子代病毒粒子中缺陷型病毒粒子(interferoninterferingparticles)占比的逐渐增加有关。而这种缺陷型病毒粒子的生成又与宿主细胞RAGB蛋白的增殖有关。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种插入RAGB编码基因的VERO细胞株，从而在用于病毒增殖时诱发细胞打开病毒增殖的信号通路，提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率。专利技术中所公开的插入RAGB编码基因的VERO细胞株，名称为VERO-RAGB，该细胞株的分类命名为非洲绿猴肾细胞，该细胞株于2019年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.18313，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，所述RAGB编码基因序列如SEQIDNO.1所示。同时，本专利技术还公开上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用RAGB编码基因的质粒转染VERO细胞株，包括以下步骤：A、培养基准备：配制含10％FBS的单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞VERO活细胞密度以及细胞活率，按照7000cell/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基清洗两次细胞，第二次漂洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；C、取500μgRAGB编码基因的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；D、设定电穿孔仪的电转程序为350V；E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，开始电转，并记录电转时长及电压；F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％FBS的单克隆培养基中，混匀；G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中。进一步的，所述构建方法还包括RAGB编码基因插入的VERO细胞的克隆筛选，筛选方法为将电转染后24小时的96孔板中的VERO细胞液添加嘌呤霉素进行处理，加入量为400mg/L；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％FBS的单克隆培养基；培养3天后提取基因组，PCR检测方式筛选阳性细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无FBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为VERO-601培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增，后接种猪流行性腹泻病毒，通过细胞的生长速度及猪流行性腹泻病毒的增殖效率再进一步筛选得到最佳的转染成功的VERO细胞株。本专利技术进一步公开了上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒培养及增殖中的应用。进一步的，本专利技术还公开了上述RAGB编码基因插入的VERO细胞株在猪流行性腹泻病毒悬浮培养及增殖中的应用。本专利技术所设计的RAGB编码基因插入的VERO细胞具有以下进步，插入该RAGB编码基因后的VERO细胞株可以合成RAGB蛋白，RAGB蛋白在猪流行性腹泻病毒感染VERO细胞的过程中可以诱发细胞打开病毒增殖的信号通路，在病毒吸附、转运、逆转录、复制以及芽殖等多个过程促进病毒的增殖。同时释放到胞外的RAGB蛋白可通过细胞膜上的识别受体，破坏未被猪流行性腹泻病毒感染正常细胞的天然免疫系统，有助于促进猪流行性腹泻病毒在细胞间的传播，显著提高猪流行性腹泻病毒在VERO细胞中的增殖效率。另外，在未经感染的VERO细胞中，RAGB蛋白的表达能够促进VERO细胞的增殖与生长。附图说明图1为Flag-pLJM1-RagB-99L质粒图谱图2为PCR鉴定结果图图3为克隆细胞过程中与VERO阴性细胞株的生长效率比较图4为筛选出的细胞1组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较图5为筛选出的细胞3组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较图6为筛选出的细胞5组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较图7为筛选出的细胞7组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较图8为筛选出的细胞8组与VERO阴性细胞株用于猪流行性腹泻病毒连续增殖结果比较具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例11、材料来源在本专利技术中用于转染的质粒为Addgene基因公司的Flag-pLJM1-RagB-99L(货号：19315)质粒。Flag-pLJM1-RagB-99L载体含有如SEQIDNO.1所示的RAGB编码基因，与用于识别转染后RAGB基因表达与否的筛选抗性标记。VERO细胞由北京鼎持生物有限公司从CCTCC引进，引进时间：2018年5月1日，CCTCC编号：CCL81。本细胞经在北京鼎持生物有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为：BJDC-201800008。实施例中用到的实验材料与试剂如表1所示表1实验材料与试剂2、Flag-pLJM1-RagB-99L的提取质粒大提试剂盒购自Qiagen公司。我们购买Addgene基因公司的Flag-pLJM1-RagB-99L后，使用质粒大提试剂盒提取大量质粒，并由上海生工生物工程有限公司测序并返回测序结果，确认无误后进行后续实验。3、基于电穿孔法进行质粒转染A、培养基准备：配置含10％FBS的CSC-03培养基960ml，配置完毕后至于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。B、宿主细胞准备：接种初始细胞浓度为0.5×106cells/ml的VERO细胞株(由ATCC驯化。)于125ml三角摇瓶中，悬浮培养3天；用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞VERO活细胞密度以及细胞活率，按照1.4×107cells总量取细胞，离心去上清，离心条件为800r/m，离心5min；再使用5mLCD-Pro培养基清洗两次去除上清液的细胞，第二次清洗后使用600μLCD-Pro培养基将细胞进行重悬，待用；C、量取500μg质粒(溶于200μLCD-Pro培养基中)加入到使用CD-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RAGB编码基因插入的VERO细胞株，其特征在于，所述VERO细胞株中插入了RAGB编码基因，名称为VERO-RAGB细胞株，该细胞株于2019年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18313,所述RAGB编码基因序列如SEQ IDNO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.RAGB编码基因插入的VERO细胞株，其特征在于，所述VERO细胞株中插入了RAGB编码基因，名称为VERO-RAGB细胞株，该细胞株于2019年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18313,所述RAGB编码基因序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的RAGB编码基因插入的VERO细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用RAGB编码基因的质粒转染VERO细胞株，包括以下步骤：A、培养基准备：配制含10％FBS的单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；
B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞VERO活细胞密度以及细胞活率，按照7000cell/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL的电转培养基将细胞重悬，待用；
C、取500μgRAGB编码基因的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；
D、设定电穿孔仪的电转程序为350V；
E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，开始电转，并记录电转时长及电压；
F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％FBS的...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯野，宋春雨，王璐，兰青，张凌云，李俊峰，赵远菲，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33