以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于肿瘤细胞免疫治疗领域，具体涉及一种以tEGFR与CD19为双靶点的CAR‑NK细胞制备方法及其应用。本发明专利技术提供的以tEGFR与CD19为双靶点的CAR‑NK细胞制备方法，包括将tEFGR的单链抗体核苷酸序列、抗CD19的嵌合抗原受体核苷酸序列导入慢病毒载体，然后转染到NK细胞，得到表达抗tEGFR抗体与抗CD19的NK细胞，即CAR‑NK细胞。本发明专利技术所制备的肿瘤免疫细胞CAR‑NK细胞能够引起相关肿瘤疾病病人的免疫应答，可用于患者本人肿瘤疾病的治疗及异体肿瘤病人注射。本发明专利技术制备的以tEGFR与CD19双靶点的CAR‑NK细胞与CAR‑T细胞相比，具有广谱抗肿瘤效果，使用范围更广。

Preparation and application of car NK cells with TEGFR and CD19 as double targets

【技术实现步骤摘要】
以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用
本专利技术属于肿瘤细胞免疫治疗领域，具体涉及一种以tEGFR(runcatedEGFR,tEGFR)与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用。
技术介绍
自然杀伤(Naturekiller,NK)细胞是机体固有免疫系统的一部分，外周血单个核细胞10％，细胞表面表达CD3-CD16+CD56+大颗粒淋巴细胞，非MHC分子限制性，无需预先治敏，而通过抑制性和激活性信号的动态平衡实现。在机体清除致病微生物、病毒的生理活动中起到十分重要的作用，无需治敏，释放穿孔素与颗粒酶，迅速杀伤或摧毁被病毒或细菌感染的细胞。除此之外，NK细胞还可释放多种细胞因子调节获得性免疫应答，从而把固有性免疫与获得性免疫应答建立联系。NK细胞需要靠两种受体保持“沉默”状态：抑制性受体KIRs和NKG2A，与细胞表面MHCI结合并传递抑制信号。NK细胞活化状态，通过激活性受体NCRs、NKp46、NKp30、NKp44和NKG2D，与细胞表面特异性配体结合，通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒直接杀伤靶细胞；同时释放TNF家族成员(如FasL)和TNF相关凋亡诱导配体TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡。NK细胞使用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，通过Fc受体CD16，可触发NK细胞对被抗体结合的靶细胞的脱粒作用。NK细胞能靶向MHC-I分子缺失的肿瘤细胞，通过释放细胞毒性穿孔素和颗粒酶，从而诱发肿瘤细胞凋亡。通过分泌一系列细胞因子，如干扰素(IFN)及肿瘤坏死因子(TNF)等，调节免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。NK细胞过继性免疫疗法：向肿瘤患者回输经体外诱导培养的NK细胞，在机体中直接或间接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。近年来，嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor,CAR)修饰的T细胞(CAR-T)逐渐引起科学家及临床医生的密切关注。肿瘤病人经过修饰过后的CAR-T细胞治疗后，生存期得到显著延长，有些病人逐渐康复。但是，在治疗过程中也发现不可避免的问题，如CAR-T细胞会在病人体内释放大量的细胞因子，也就是所谓的“风暴因子”，引起病人严重的免疫反应如心脏毒性、肝脏毒性。除此之外，CAR-T细胞还会引起病人神经毒性。NK细胞因其独特的识别靶细胞能力及抗肿瘤能力，有望取代CAR-T细胞。已经被FDA批准治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的CAR-T细胞，该CAR-T细胞就是以B细胞上的CD19为靶标。CD19高表达在B细胞上，更加有利于Car-T识别B细胞。EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR突变或过表达一般会引发肿瘤，它是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，跨细胞膜，分子量170KDa。研究表明，在多种肿瘤细胞中存在EGFR的高表达或异常表达，它的高表达或异常表达与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。中国专利申请CN109923212A公开了一种用于表达乙肝病毒(HBV)抗原的慢病毒载体，所述载体编码至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白，至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心，以及至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心MHCI和MHCII表位，可以用于向人给药以诱导针对HBV抗原的免疫应答，但是，这种载体需要极高的准确率，故不适宜大规模生产，且操作过程复杂，容易被其他基因干扰试验结果。综上可知，现有技术普遍存在检测结果准确率低，操作复杂，对特定细胞杀伤力低等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的缺点，提供一种以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用。本专利技术提供的CAR-NK细胞，以tEGFR及CD19为双靶点，可以有效检测肿瘤细胞的异常表达，准确率高，适用于大规模生产，而且操作简单，有效提高了对白血病、淋巴瘤细胞的杀伤能力。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列信息如SEQIDNO.1所示。优选地，所述CAR-NK序列包括tEGFR的单链抗体核苷酸序列和CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列。优选地，所述tEGFR的单链抗体核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，包括编码前导肽的序列，核苷酸信息如SEQIDNO.2第1-57位核苷酸所示；抗tEGFR单链抗体的的轻链可变区，核苷酸序列信息如SEQIDNO.2第60-324位氨基酸所示；抗tEGFR单链抗体的重链可变区，核苷酸序列如SEQIDNO.2第444-804位核苷酸所示；编码人tEGFR跨膜区氨基酸的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第816-954位核苷酸所示；人tEGFR铰链区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第957-1026位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第1029-1164位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第1167-1494位核苷酸所示；tEGFR-SCFV片段，序列信息如SEQIDNO.2第792-1782位核苷酸所示。优选地，所述CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列信息如SEQIDNO.3所示，包括前导肽的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第1-69位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的轻链可变区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第78-426位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的重链可变区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第483-1857位核苷酸所示；人CD28跨膜区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第1962-2424位核苷酸所示；人CD8铰链区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第2538-2856位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第2964-3582位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第3660-4017位核苷酸所示；抗CD19的SCFV片段含有264-594位核苷酸序列；抗CD19-SCFV片段，序列信息如SEQIDNO.3第792-1782位核苷酸所示。本专利技术还提供了一种所述的CAR-NK细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、人工构建CAR-NK序列：按照tEGFR—CD19的顺序排列，于公司合成人工序列，得人工合成的CAR-NK序列；S2、将步骤S1所得人工合成的CAR-NK序列通过酶切的方法整合到慢病毒质粒载体pWCDX1中，得重组质粒载体；S3、将步骤S2所得重组质粒载体转染入NK细胞，即得。优选地，所述步骤S2中的酶切方法指利用EcoRI/HindIII双酶切载体与CAR-NK碱基序列，得相同的酶切末端，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列信息如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列信息如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所示的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列包括tEGFR单链抗体核苷酸序列和CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列。


3.如权利要求2所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述tEGFR的单链抗体核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，包括编码前导肽的序列，核苷酸信息如SEQIDNO.2第1-57位核苷酸所示；抗tEGFR单链抗体的的轻链可变区，核苷酸序列信息如SEQIDNO.2第60-324位氨基酸所示；抗tEGFR单链抗体的重链可变区，核苷酸序列如SEQIDNO.2第444-804位核苷酸所示；编码人tEGFR跨膜区氨基酸的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第816-954位核苷酸所示；人tEGFR铰链区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第957-1026位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第1029-1164位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.2第1167-1494位核苷酸所示；tEGFR-SCFV片段，序列信息如SEQIDNO.2第792-1782位核苷酸所示。


4.如权利要求2所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列信息如SEQIDNO.3所示，包括前导肽的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第1-69位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的轻链可变区的核苷酸，序列信息如SEQIDNO.3第78-426位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的重链可变区的核苷酸，序列信息...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐单单，陈素红，黄慧清，王霞，
申请(专利权)人：广东食品药品职业学院，
类型：发明
国别省市：广东;44