一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法技术

本发明专利技术属于运用细胞生物学检测技术领域，公开了一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，包括花青素溶液制备、大鼠胰岛β细胞的培养、花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围筛查、流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型、活性氧自由基水平实验和蛋白印迹方法验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型、细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果、建立RFP‑GFP‑RIN稳定细胞株检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果、结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体和自噬流效果判断。本发明专利技术为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果建立高通量筛选方法，并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。

A method for detecting the autophagy of rat islet \u03b2 cells induced by anthocyanin

The invention belongs to the field of cell biology detection technology, and discloses a method for detecting the effect of anthocyanin induced autophagy of rat islet \u03b2 cells, including the preparation of anthocyanin solution, the culture of rat islet \u03b2 cells, the screening of the toxic concentration range of anthocyanin on rat islet \u03b2 cells, the construction of high sugar rat islet \u03b2 cell apoptosis model and the level of active oxygen free radical by flow cytometry Experiments and Western blotting were carried out to verify the apoptosis model of rat islet \u03b2 cells induced by high glucose, the autophagy effect of rat islet \u03b2 cells induced by anthocyanin was detected by cell immunofluorescence method, the autophagy effect of rat islet \u03b2 cells induced by anthocyanin was detected by establishing stable cell line of rfp-gfp-rin, the autophagy effect of rat islet \u03b2 cells induced by anthocyanin and the autophagy effect of rat islet \u03b2 cells induced by anthocyanin were judged. The invention establishes a high-throughput screening method for the anthocyanin induced autophagy effect of rat islet \u03b2 cells, and provides a theoretical basis for the anthocyanin induced autophagy effect of rat islet \u03b2 cells to prevent diabetes.

【技术实现步骤摘要】
一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法
本专利技术属于运用细胞生物学检测
，尤其涉及一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：根据世界卫生组织预测2025年全球糖尿病患者突破6亿，增长率高达55％。全球诊断和治疗糖尿病每年花费高达825亿美元。糖尿病主要分为1型、2型以及妊娠糖尿病，其中2型糖尿病占90％以上。胰岛素在体内呈双相分泌，2型糖尿病人的胰岛素在一相高于正常或正常，在二相的高峰延迟，其主要是由于胰岛β细胞数量减少、功能受损以及胰岛素抵抗而形成。胰岛β细胞数量的减少和功能的紊乱与糖毒性、脂毒性等因素密切相关。短期高血糖刺激胰岛素的合成分泌及葡萄糖的利用，而长期的高血糖却被称为糖毒性，长期的高血糖不仅导致胰岛β细胞数量的减少和功能的失常，加剧体内胰岛素抵抗，这些主要是由于糖毒素使得胰岛β细胞发生凋亡和坏死。已有研究报道胰岛β细胞凋亡的信号转导途径主要包括外源性途径、内源性途径以及颗粒酶β途径。这些凋亡信号通路的共同特征是：各种氧化应激和刺激信号激活特定的转导通路，最终激活半胱天冬蛋白酶(caspase)。激活的caspase剪切胞内底物，从而破坏细胞特有的形态结构和影响细胞代谢活动，导致细胞发生凋亡。因此，胰岛β细胞受损及功能障碍是2型糖尿病发病的核心环节，而胰岛β细胞的凋亡在此也扮演了重要角色。自噬是细胞利用溶酶体降解已受损的大分子物质和细胞器的过程，自噬连续不断清理错误折叠的蛋白质、有害的代谢产物、老化的线粒体等细胞器，从而保持胰岛β细胞的正常状态。在自噬突变的胰岛β细胞中发现内质网以及线粒体障碍，扰乱胰岛β细胞功能。自噬维持胰岛β细胞的数量、结构及功能从而延缓糖尿病的过程。研究发现在敲除自噬相关基因的小鼠中胰岛β细胞不仅形态发生改变，且胰岛素分泌下降。在糖尿病小鼠模型中发现自噬水平的变化伴随着胰岛β细胞的凋亡率显著增加和胰岛素分泌的下降。自噬在胰岛素的存储和释放过程中也扮演着重要的角色，胰岛β细胞中的自噬水平与胰岛素含量成正比，从而推测自噬参与胰岛素颗粒胞吐的分泌过程，在ADP敏感的K+离子通道和电压依赖性的Ca2+离子通道中起着积极的作用。因此自噬在维持胰岛β细胞数量、结构、功能功能及内环境稳定中起着重要的作用，从而达到预防糖尿病的作用。花色苷主要存在于果蔬及谷物中，在自然界中主要是由六种花青素单体通过不同的酰基和糖基化构成。由于B环上R1和R2连接的甲氧基和羟基的不同形成了六种花青素单体，而六种花青素单体所具备的生物功效不同。广泛的研究表明花青素具有很强的自由基清除和抗氧化活性能力，在预防心血管疾病、肿瘤、糖尿病中发挥着重要的作用。桑树果实花色苷提取物素通过抗氧化应激抑制胰岛β细胞凋亡，从而预防糖尿病。枸杞中分离的花色苷通过ERK1/2和PI3K/Akt通路上调HO-1蛋白的表达水平，从而保护胰岛β细胞免于H2O2诱导的损伤。蓝莓中的花色苷提取物促进胰岛βTC-tet细胞增殖，同时还抑制由高糖诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12的凋亡。但是不同花青素单体在正常和凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体能力及其自噬能力与构效关系尚未报道。因此，亟需一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法以弥补现有技术在这一领域的空白。综上所述，现有技术存在的问题是：不同花青素单体在正常和凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞的自噬体能力及其自噬能力与构效关系尚未报道。解决上述技术问题的难度：花色苷作为一种天然的植物多酚，具有抗氧化、抗炎症、预防心血管疾病等功效，特别是在防治糖尿病方面具有明显的作用，有研究发现花色苷主要通过减少氧化应激、改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌和保护胰岛β细胞等4个方面来防治2型糖尿病。自噬被认为是胰岛β细胞的自我保护机制之一，对于维持胰岛β细胞的结构、数量和功能至关重要。目前尚无有效检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的技术，进而根据花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果评价花青素在预防糖尿病中的作用的技术。解决上述技术问题的意义：本专利技术采用检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞静态自噬体数目、动态自噬流和建立高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型相结合的方法，能客观的评价花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬的效果；通过建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株构建了高通量检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法；为检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果建立了高通量筛选方法，并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，以花青素单体作为实验材料，以大鼠胰岛β(RIN-m5F)细胞为研究对象，主要通过高糖对细胞活力和凋亡率的影响初步确定高糖凋亡模型的条件，分析其对细胞内活性氧(ROS)水平以及细胞凋亡蛋白的影响进一步验证高糖凋亡模型。其次通过细胞免疫荧光方法检测花青素在正常和高糖凋亡模型中诱导大鼠胰岛β细胞自噬体效果；建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；最后结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。以期为为检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果建立了高通量筛选方法，并为花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病提供理论依据。本专利技术是这样实现的，一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：步骤一，将花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存；步骤二，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞；步骤三，花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查；步骤四，利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；步骤五，活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；步骤六，细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；步骤七，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果；步骤八，建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选；步骤九，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；步骤十，结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。进一步，步骤三中花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查包括以下步骤：1)将含2×104个细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔取200μL，放置在37℃培养箱培养12h；2)细胞单层贴壁生长后，按照终浓度为25-200μM添加六种花青素于37℃培养箱继续培养8h；3)培养结束后，每孔按照1:10的比例加入20μLCCK-8溶液继续培养2h；4)使用酶标仪在450nm测定各个样品的OD值；5)同时设置空白组，只加入培养基和CCK-8试剂；阴性组不加待测药物细胞孔，每组设定5个复孔；并根据公式计算出细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：/n步骤一，将芍药素、天竺葵素、锦葵素、矢车菊素、飞燕草素以及矮牵牛素六种花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存；/n步骤二，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞；/n步骤三，花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查；/n步骤四，利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；/n步骤五，活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；/n步骤六，细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；/n步骤七，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果；/n步骤八，建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选；/n步骤九，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；/n步骤十，结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：
步骤一，将芍药素、天竺葵素、锦葵素、矢车菊素、飞燕草素以及矮牵牛素六种花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存；
步骤二，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞；
步骤三，花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查；
步骤四，利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；
步骤五，活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；
步骤六，细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；
步骤七，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果；
步骤八，建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选；
步骤九，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；
步骤十，结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。


2.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤三中花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查包括以下步骤：
1)将含2×104个细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔取200μL，放置在37℃培养箱培养12h；
2)细胞单层贴壁生长后，按照终浓度为25-200μM添加六种花青素于37℃培养箱继续培养8h；
3)培养结束后，每孔按照1:10的比例加入20μLCCK-8溶液继续培养2h；
4)使用酶标仪在450nm测定各个样品的OD值；
5)同时设置空白组，只加入培养基和CCK-8试剂；阴性组不加待测药物细胞孔，每组设定5个复孔；并根据公式计算出细胞存活率；
细胞活力(％)＝(处理组OD-空白组OD)/(阴性组OD-空白组OD)×100％，细胞毒性(％)＝(阴性组OD-处理组OD)/(阴性组-空白组)×100％。


3.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤四中利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：
1)将5×105个细胞悬浮液接种于12孔细胞板中，培养12h；
2)每孔加入终浓度10、20和30mM的葡萄糖后分别培养24、36以及48h；
3)培养结束后，将每孔培养基分别吸入到离心管(1)中，用PBS清洗每孔1次并转入到对应的离心管(1)中；
4)然后每孔加入200-300ul不含EDTA的胰酶，消化细胞30s后直接加入2mL10％胎牛血清的RPMI1640培养液轻轻吹打，让贴壁细胞悬浮于培养液中，再移入到新的离心管(2)中；
5)将离心管(2)在1000rpm条件下离心8min，再将上清液转入到对应的离心管(1)中，在3000rpm条件下离心8min，去除上清液；
6)用2mLPBS分别加入到离心管(1)和(2)中，用移液枪轻柔重悬细胞；
7)将离心管(1)中的悬浮细胞分别用1000rpm×8min再次离心一次，将上清液转入到对应的离心管(2)中，3000rpm×8min离心，去除上清液；
8)加入300-500ul的Bindbuffer重悬细胞，将离心管(1)和对应(2)细胞混合；
9)轻柔混匀之后，过200目细胞筛至离心管中，得到待测细胞悬浮液；
10)使用流式细胞仪器前，每处理500uL加入5ulAnnexin-V-FICT，室温孵育10min，混匀；
11)随后加入5ulPI混匀，室温孵育5min；
12)用激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm流式细胞仪器检测大鼠胰岛β细胞凋亡情况；
13)根据大鼠胰岛β细胞凋亡情况，确定大鼠胰岛β细胞凋亡模型条件为30mM和36h。


4.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤五中活性氧自由基ROS水平实验包括以下步骤：
1)通过荧光探针DCFH-DA标记细胞内ROS水平；
2)按照细胞免疫荧光方法制备细胞爬片；以终浓度为50μmol/L的DCFH-DA加入各组处理组中，在37℃孵育50min，随后用PBS洗3遍；分别采用488nm和510nm的最大激发波长和发射波长检查细胞的荧光强度，拍照。


5.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤六中细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：
1)细胞培养：RIN-m5F细胞株用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、100％饱和湿度、5％CO2条件下常规传代培养；
2)蛋白回收：待细胞处理结束后，弃培养液，用预冷的PBS洗两遍；每孔加入10％SDS；充分混匀后移至新离心管中，冰上孵育20-30min，置100℃金属浴10min，随后加入6×loadingBuffer，充分振荡混匀，再次10...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖灯妮，邓放明，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43