修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途制造技术

本发明专利技术涉及修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途，具体而言，本发明专利技术提供了修饰的核苷、核苷酸和核酸以及使用它们的方法。

Modified nucleosides, nucleotides and nucleic acids and their uses

The invention relates to modified nucleosides, nucleotides and nucleic acids and their uses, in particular, the invention provides modified nucleosides, nucleotides and nucleic acids and methods for using them.

【技术实现步骤摘要】
修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途本申请是申请号为201280059453.0，申请日为2012年10月3日，专利技术名称为“修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途”的中国专利申请的分案申请。关于序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表文件，名称为M009SQLST.txt，创建于2012年10月3日，大小为9,859字节。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。相关申请的交叉引用本申请要求提交于2011年10月3日的名称为ModifiedNucleosides,Nucleotides,andNucleicAcids,andUsesThereof(修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途)的美国临时专利申请号61/542,533的优先权，将其内容以引用的方式整体并入本文。
本专利技术提供了使用修饰的核酸来调节细胞功能的组合物和方法。本专利技术的修饰的核酸可编码肽、多肽或多种蛋白。所编码的分子可以用作治疗剂(therapeutics)和/或诊断剂(diagnostics)。
技术介绍
天然存在的RNA是由四种基本的核糖核苷酸：ATP、CTP、UTP和GTP合成，但可含有转录后修饰的核苷酸。此外，在RNA中已鉴定出约100种不同的核苷修饰(Rozenski,J，Crain,P和McCloskey,J.(1999).TheRNAModificationDatabase:1999update.NuclAcidsRes27:196-197)。然而，还不清楚核苷修饰对免疫-刺激潜力和对RNA的翻译效率的作用。影响蛋白表达的现有方法中存在很多问题。例如，引入细胞中的异源DNA可以被子细胞(不论异源DNA是否已整合到染色体中)或后代继承。引入的DNA可以以某一频率整合到宿主细胞的基因组DNA中，造成对宿主细胞的基因组DNA的改变和/或损伤。此外，在制造蛋白前必须经过多个步骤。一旦进入细胞内部，DNA必须被转运到细胞核中，在细胞核中其被转录成RNA。然后由DNA转录的RNA必须进入细胞质，在细胞质中其被翻译成蛋白。对多个处理步骤的这种需要在生成目标蛋白前产生滞留时间。另外，也难以得到细胞中的DNA表达；DNA频繁地进入细胞，但不表达或不以合理的速率或浓度表达。这可能是当将DNA引入到细胞如原代细胞或修饰的细胞系时的特殊问题。在本领域中需要解决核酸的细胞内翻译的调节的生物学方法。
技术实现思路
本专利技术尤其提供了修饰的核苷、修饰的核苷酸和修饰的核酸，其在被引入到细胞群中时，在体内和离体可显示出降低的先天免疫应答。本专利技术提供了可被分离或纯化的多核苷酸。这些多核苷酸可以编码一种或多种目标多肽并包含n个连接的核苷或核苷酸的序列，其中所述核苷或核苷酸包含至少一个与A、G、U或C核苷或核苷酸的化学结构相比修饰的核苷或核苷酸。多核苷酸也可以含有包含至少一个Kozak序列的5'UTR、3'UTR和至少一个5'帽结构。分离的多核苷酸还可以含有聚A尾(poly-Atail)且可以被纯化。本专利技术的分离的多核苷酸还包含至少一个5'帽结构，其选自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。本专利技术的多核苷酸的修饰可以是在多核苷酸所包含的核苷的核苷碱基和/或糖部分上。在一些实施方式中，修饰是在核碱基上，且选自假尿苷或N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，修饰的核苷不是假尿苷(ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方式中，在修饰的核酸中或在一个或多个单独的核苷或核苷酸中包括多个修饰。例如，对核苷的修饰可以包括一个或多个对核碱基和糖的修饰。在一些实施方式中提供了用于制备修饰的多核苷酸的新的构建块(例如，核苷和核苷酸)及其合成和生产方法。本专利技术还提供了包含本文所述的修饰的多核苷酸的药物组合物。其还可以进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂选自溶剂、水溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质(lipidoid)脂质体、脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、聚合物、脂复合物(lipoplexe)肽、蛋白、细胞、透明质酸酶、及它们的混合物。还提供了使用本专利技术的多核苷酸和修饰的核酸的方法。在这种情况下，多核苷酸可通过本领域中已知的任何方法进行配制，或通过包括皮内、皮下或肌内注射的若干途径中的任何途径进行施用。本专利技术的修饰的核酸的施用可以经由两个或更多个相等或不等的分次剂量。在一些实施方式中，通过施用分次剂量的多核苷酸，受试者所产生的多肽的水平大于单次施用相同总日剂量的多核苷酸所产生的水平。修饰的核酸或编码的多肽的检测可以在受试者或患者的体液中进行，其中所述体液选自外周血液、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper'sfluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液(blastocylcavityfluid)和脐带血。在一些实施方式中，施用是根据给药方案进行的，可历经几小时、几天、几周、几月或几年的时间，并且施用可以通过使用一种或多种装置来实现，所述装置选自多针注射系统；导管或管腔系统；和基于超声、电或辐射的系统。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所述的方法和材料用于本专利技术；也可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在进行限制。所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目(databaseentries)和在此提及的其它参考文献以引用的方式整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本专利技术的其它特征和优点根据下面的详细描述和附图以及根据权利要求书是显然的。附图说明上述和其它目的、特征和优点根据以下如附图中所示的本专利技术的具体实施方式的描述是显然的，其中在不同的视图中相同的参考字符是指相同的部件。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本专利技术的各种实施方式的原理。图1提供了N4-Me-CTP(化合物1的NTP)的分析结果的谱图。对于N4-甲基胞苷(N4-Me-胞苷，化合物1)，图1A提供了在DMSO中的核磁共振(NMR)谱，图1B提供了在D2O中的NMR谱，图1C提供了质谱(MS)结果，图1D是高效液相色谱法(HPLC)的结果。图2示出了N4-Me-CTP(化合物1的NTP)的HPLC结果。图3提供了2'-OMe-N,N-二-Me-CTP(化合物2的NTP)的分析结果。图3A提供了NMR波谱。图3B提供了MS结果。图3C提供了2'-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：/n(a)编码所述多肽的开放阅读框，所述开放阅读框由包含胞苷、腺苷、鸟苷和包含具有式XII-b的结构的核碱基的核苷的核苷组成/n

【技术特征摘要】
20111003 US 61/542,5331.一种编码多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：
(a)编码所述多肽的开放阅读框，所述开放阅读框由包含胞苷、腺苷、鸟苷和包含具有式XII-b的结构的核碱基的核苷的核苷组成



其中：R3sC2-4烷基，
(b)5'UTR，
(c)3'UTR，和
(d)5'帽结构。


2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其进一步包含聚-A尾。


3.如权利要求2所述的分离的多核苷酸，其是纯化的。


4.如权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中至少一个5'帽结构选自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。


5.如权利要求1-4任一项所述的分离的多核苷酸，其中R3是CH2烷基。


6.一种药物组合物，其包含如权利要求1-5任一项所述的分离的多核苷酸和药学上可接受的赋形剂。


7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含脂质纳米颗粒。


8.一种增加哺乳动物受试者的目标多肽的水平的方法，所述方法包括对所述受试者施用如权利要求1-5任一项所述的分离的多核苷酸或权利要求6或7所述的药物组合物。


9.如权利要求8所述的方法，其中分离的多核苷酸以1ug至150ug的总日剂量施用。


10.如权利要求8或9所述的方法，其中通过注射施用。


11.如权利要求8或9所述的方法，其中经皮内或皮下或肌内施用。


12.如权利要求8-11任一项所述的方法，其中哺乳动物的血清中的目标多肽的水平在施用后至少2小时为至少50pg/mL。


13.如权利要求12所述的方法，其中哺乳动物的血清中的目标多肽的水平在施用后保持大于50pg/mL至少72小时。


14.如权利要求13所述的方法，其中哺乳动物的血清中的目标多肽的水...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东宁·德富热罗勒，阿坦恩·洛依，杰森·P·斯洛姆，S·西德奇，保罗·哈塔拉，斯蒂芬·邦塞尔，
申请(专利权)人：现代泰克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US