一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的组织表达量的检测方法。首先从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行HSP70基因5'‑和3'‑序列的克隆，并利用软件对克隆得到的HSP70cDNA部分序列、5'‑和3'‑序列进行拼接。序列含有2348个碱基，开放阅读框(ORF)1950个碱基，编码649个氨基酸。采用荧光实时定量PCR技术检测肝、肾、脾组织中Hsp70的表达量。通过周期性饥饿‑投喂对短须裂腹鱼幼鱼肝、肾、脾组织HSP70基因表达影响研究，得出肾脏可以作为研究饥饿应激的靶器官。为研究短须裂腹鱼Hsp70表达调控机理奠定基础。

HSP70 gene, detection method and application of heat stress protein in Schizothorax brevis

The invention discloses a method for detecting the tissue expression amount of HSP70 gene of Schizothorax brachynchus. Firstly, the total RNA was extracted from the liver of Schizothorax brevis, and the first strand of cDNA was obtained by reverse transcription. The 5 '- and 3' \u2011 sequences of HSP70 gene were cloned by race amplification, and the partial, 5 '- and 3' \u2011 sequences of HSP70 cDNA were spliced by software. The sequence contains 2348 bases, 1950 bases of ORF and 649 amino acids. The expression of HSP70 in liver, kidney and spleen was detected by real-time PCR. Through the study of the effect of periodic starvation on HSP70 gene expression in liver, kidney and spleen tissues of Schizothorax breviscapus, it is concluded that kidney can be used as the target organ to study starvation stress. This study laid a foundation for the study of the regulation mechanism of HSP70 expression in Schizothorax brevis.

【技术实现步骤摘要】
一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用。
技术介绍
热应激蛋白作为分子伴侣，是进化上高度保守、功能上至关重要的蛋白，广泛存在于从低等原核生物到高等哺乳动物的整个生物界。HSP70是HSPs家族中的重要成员之一，它在正常情况呈低水平的本底表达，在应激条件下(温度、渗透压、炎症、微生物感染、重金属、饥饿和缺氧等)可诱导上调表达，它作为分子伴侣参与蛋白质合成、折叠、装配和运输，可以修复和降解部分变性或已损坏的蛋白，从而增强机体的抗应激能力。HSP70作为生物体抗逆的重要分子，其表达水平的高低可以作为评价机体应激程度和应激能力的重要指标。短须裂腹鱼(Schizothoraxwangchiachii)隶属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，主要分布于金沙江、乌江和雅砻江；因过度捕捞、环境污染、水电开发等原因，野生短须裂腹鱼资源越来越少，目前已经开展人工养殖。但是，目前，有关于短须裂腹鱼的热应激蛋白HSP70基因还没有相关的报道，其序列也未知，阻碍了对短须裂腹鱼应激能力检测的研究的发展。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用。本专利技术是这样实现的，一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因，所述热应激蛋白HSP70基因的核苷酸序列见SEQIDNO.13。进一步，所述热应激蛋白HSP70基因编码的蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO.14。一种如上所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列检测方法，包括以下步骤：步骤1：提取短须裂腹鱼RNA；步骤2：以步骤1中提取的RNA为模板，合成cDNA；步骤3：根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物，以步骤2中获取的cDNA为模板，克隆HSP70的中间部分序列；步骤4：获取目标基因5’端序列；步骤5：获取目标基因3’端序列；步骤6：将步骤3、步骤4和步骤5获得的序列进行全长拼接，获得完整的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列。进一步，步骤3中根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物的序列见SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。进一步，步骤4和步骤5中分别采用5′RACE试剂盒和3′RACE试剂盒获取目标序列。一种如上所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因在短须裂腹鱼应激能力检测中的应用。进一步，检测方法包括针对所述短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因设计的引物序列，分别见SEQIDNO.15和SEQIDNO.16。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行HSP70基因5'-和3'-序列的克隆，利用软件对克隆得到的HSP70cDNA部分序列、5'-和3'-序列进行拼接成为HSP70cDNA全长序列。2348个碱基，开放阅读框(ORF)1950个碱基，编码649个氨基酸。采用荧光实时定量PCR技术检测肝、肾、脾组织中Hsp70的表达量。为研究短须裂腹鱼Hsp70表达调控机理奠定基础。目前，短须裂腹鱼的热应激蛋白HSP70基因的检测方法和组织表达的检测方法还没有相关的报道，本专利技术则可填补这一技术空白，对于深入研究其应激调节中的生物学功能提供理论依据。附图说明图1是获取中间片段产物的电泳结果；图2是获取5’端序列产物的电泳结果；图3是获取3’端序列产物的电泳结果；图4是HSP70基因全长序列及氨基酸结果图；图5是短须裂腹鱼不同组织中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；图6是实施例3中肝脏中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；图7是实施例3中脾中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；图8是实施例3中肾中HSP70基因mRNA水平的相对表达量。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术披露了一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用，具体如下各实施例所示。实施例1目标基因克隆步骤1：提取RNA1)短须裂腹鱼经过MS-222麻醉后解剖，快速分离肝胰脏组织置于冻存管，于液氮中速冻后转移-80℃保存备用。从液氮中取出肝脏组织约80mg，置于预冷的研钵中，趁液氮尚未挥发光时，将组织磨成粉末，并迅速加入1mLTrizol。匀浆后，Trizol/组织混合物室温放置5min，以便样本被Trizol充分裂解。2)每1mLTrizol裂解的样本加入200μL氯仿即三氯甲烷。3)盖严管盖，上下剧烈摇晃15秒。4)室温放置3min。5)在4℃下12000g离心15min。6)离心后，管中液体将分层，转移最上层的无色液体(约总体积50％左右)至一个新的无RNA酶的EP管中。注意：千万不能吸到下层的液体及悬浮在中间的白色沉淀物。吸取的时候，将EP管倾斜成45°角。7)向新的上层液体中加500μL100％异丙醇。8)室温放置10min。9)在4℃下12000g离心10min。10)小心吸去上清，加入75％乙醇，75％乙醇要用DEPC水配置。11)上、下颠倒八次，7500g，4℃离心5min。12)除去乙醇后，开盖室温放置5-10min，即得到纯化的RNA。13)DEPC水溶解后，琼脂糖电泳检测分子的完整情况，分光光度法检测其浓度。步骤2：cDNA的合成该步骤使用Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒完成，具体如下：1)在无RNA酶的PCR管中加入1μg的总RNA，和1μL的100μM的oligo(dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12μL。2)将上述混合液于65℃处理5分钟，然后在冰上立即冷却1分钟。3)然后再在反应液中依次加入4μL5Xreactionbuffer、1μLRiboLockRNaseInhibitor(20μ/μL)、2μL10mMdNTPmix、1μLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase(200μ/μL)。4)将其轻轻混匀，并短暂离心。5)在PCR仪上42℃孵育1个小时。6)70℃孵育5分钟结束反应。步骤3：中间片段调取根据已知的鱼类的HSP70基因的保守区序列设计引物即HSP70F:CTGGGCACCACCTACTCCTGTG，见SEQIDNO.1和HSP70R:GTACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因，其特征在于：所述热应激蛋白HSP70基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.13。/n

【技术特征摘要】
1.一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因，其特征在于：所述热应激蛋白HSP70基因的核苷酸序列见SEQIDNO.13。


2.根据权利要求1所述的一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因，其特征在于：所述热应激蛋白HSP70基因编码的蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO.14。


3.一种如权利要求1或2任一所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取短须裂腹鱼RNA；
步骤2：以步骤1中提取的RNA为模板，合成cDNA；
步骤3：根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物，以步骤2中获取的cDNA为模板，克隆HSP70的中间部分序列；
步骤4：获取目标基因5’端序列；
步骤5：获取目标基因3’端序列；
步骤6：将步骤3、步骤4和步骤5获得的序列进行全长拼接，获得完整的短须裂腹鱼热...

【专利技术属性】
技术研发人员：王崇，梁银铨，
申请(专利权)人：水利部中国科学院水工程生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42